【毕业学位论文】（Word原稿）中国小麦条锈菌鉴别寄主尤皮Ⅱ号、阿夫抗条锈病基因定位及分子标记作物抗病遗传学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士论文 中国小麦条锈菌鉴别寄主尤皮 号、阿夫 抗条锈病基因定位及分子标记 i 摘 要 小麦条锈病是一种世界性病害，中国是世界上最大的小麦条锈病流 行区，条锈菌又是一个相对独立的流行区系。 由于小麦条锈菌尚未发现有性阶段，利用寄主的抗病基因也就成为鉴定小种致病基因的唯一途径。因此， 明确中国小麦条锈菌鉴别寄主的抗条锈基因及其遗传特点， 是监测小麦条锈菌生理小种动向，进行生理专化研究的基础，并将 我国小种鉴定和品种抗病性分析提高到基因分析水平，将基因分析工作纳入国际轨道，为抗病育种和基因布局提供依据。 尤皮号、夫是重要的中国小麦条锈菌鉴别寄主， 明确其抗条锈基因，并标记、定位，具有重要的理论与实际意义。 本研究采用常规杂交分析方法，明确了以中国 小麦条锈菌鉴别寄主尤皮号为抗性供体，以至今尚未发现有抗条锈基因的 背景转育而成的抗条锈 近等基因系 号 对 中国条锈菌系 1的抗性由 1对 显性基因 控制。通过 用位于2B、 4B 染色体上的 物，对近等基因系 号及其轮回亲本 的基因组 增和电泳分析，结果显示， 在 99 对 物中有2 对引物 近等基因系和轮回亲本间稳定扩增出了有多态性的 段，在近等基因系中扩增出的特异片段同时也出现在抗性供体亲本尤皮号中。遗传连锁性检验表明， 微卫星 标记 目的基因连锁，在抗、感亲本中扩增出多态性条带为 证明 该基因为 所获 标记 目的基因不连锁。用 59株 单株，有 1株发生交换， 据 （ 1998）微卫星图谱，确定抗条锈基因皮号是具有特别鉴别能力的中国小麦条锈菌鉴别寄主，建议将此基因按国际编号命名为 照基因供体 含抗条锈基因 用 6A、 3B、 6B 染色体上 116 对 物，对其近等基因系。结果表明，有 10对引物在近等基因系和轮回亲本间有多态性。 为进一步标记和定位该基因奠定了基础。 采用常规杂交分析方法，对铭贤 169与阿 夫杂交的 、 果表明，阿夫对 2系的抗性至少由 1 对显性抗条锈基因控制；通过单体分析将阿夫抗 2对显性基因定位在 3位性分析表明该基因不同于目前的已知基因。 关键词： 小麦条锈菌，鉴别寄主，抗性基因，单体分析，微卫星标记 录 第一章 绪 论 . 1 1 小麦条锈病抗性遗传研究历史 . 2 2 小麦条锈病抗性遗传研究现状 . 2 麦抗条锈病基因的遗传分析与定位 . 2 麦条锈病抗病基因的分子标记 . 4 3 植物抗病基因分子标记方法及应用 . 5 记 . 5 记 . 6 记 . 7 记 . 7 记 . 8 记 . 8 记 . 9 . 9 D . 9 4 小麦条锈菌鉴别寄主抗性遗传研究现状及意义 . 10 第二章 研究目的、意义和研究内容 . 15 1 研究目的和意义 . 15 2 研究内容 . 16 *6/ 6 与轮回亲本 态性分析 . 16 3 技术路线 . 17 第三章 中国小麦条锈菌鉴别寄主阿夫抗条锈基因染色 体定位 . 18 1 材料与方法 . 18 试小麦品种（系）及杂交组合配制 . 18 试小麦条锈菌生理小种（菌系）及菌种繁殖与保存 . 18 期抗病性鉴定 . 19 体分析原理 . 19 2 结果与分析 . 20 夫抗 2系的基因遗传特点研究 . 20 夫对 2系的抗条锈主效基因的染色体定位 . 20 夫与供试品种中抗 2系基因的异同比较 . 22 3 结论与讨论 . 22 第四章 尤皮号抗条锈基因分子标记的建立及基因定 位 . 25 1 材料与方法 . 25 号抗条锈基因遗传分析 . 25 号抗条锈基因的 记定位 . 25 卫星扩增 . 27 增产物的检测 . 28 记对近等基因系 号不同株系进行分子检测 . 30 2 结果与分析 . 30 麦抗条锈近等基因系 号的抗性基因分析 . 30 麦叶片基因组 取与检测 . 30 号抗条锈基因的标记、定位及检测 . 31 记检测近等基因系 号的不同株系 . 36 2 5 因与 因的异同比较 . 37 3讨论 . 37 因连锁的分子标记建立 . 37 号中 已知基因的异同比较 . 37 等基因系目的基因的分子检测 . 38 术操作中值得注意的问题 . 38 第五章 、 1 基因组 提取 . 41 2、 2、微卫星扩增 . 41 2、 3 扩增产物的检测 . 41 3 结果与分析 . 41 ，生产中常常受到各种病害的威胁，其中小麦条锈病是小麦生产上的一种重要病害。我国是世界上重要的小麦产区，也是最大的小麦条锈病流行区。小麦条锈病是由小麦条锈菌（ 起的一种气传叶部病害，在全世界各小麦种植区均有不同程度的发生，在高纬度或高海拔的地区危害尤为严重。小麦条锈病流行时可使小麦减产 20%大流行年份产量损失可高达 50% 50 年代至今，我国曾发生 16次 条锈病中度流行， 8次较大规模流行，其中 1950年、 1964年、 1990年、 2002 年四次大流行发生面积最大，危害也最严重，给我国小麦生产造成严重损失。随着小麦条锈菌毒性谱更宽的生理小种条中 30 和条中 31 号的出现及其频率增加，导致 1996 年四川、陕南和陇南等地小麦条锈病的 大流行。尤其是近年来小麦条锈菌条中 32、 31 的毒力频率直线上升，新小种的发展已经波及我国近 1300多万公顷小麦。 小麦品种抗锈性“丧失”问题，不仅是我国小麦生产上的一个突出问题，同时也是世界上许多产麦国家尚未解决的一个难题。据报道， 1971至 1975年，全世界有 26 个国家发现有小麦品种“丧失”抗锈性的情况。因此小麦品种抗锈性的“丧失”问题是锈病研究和抗病育种工作面临的长期课题，决定了该病防治的长期性和复杂性。 长期的系统研究表明，大面积推广种植抗病基因相对单一的品种，造成抗病品种对病菌毒性小种的定向选择，导 致小麦条锈菌毒性更宽的新小种出现和发展，是造成小麦品种抗病性“丧失”的主要原因。近年来，国内外学者就如何利用小麦 品种抗锈性问题开展了广泛的讨论，提出了许多有重要价值的理论和方法。主要有合理利用垂直抗性品种，如培育多系品种、聚合品种，实行品种轮换，品种组合以及对抗源品种进行合理布局，利用水平抗性品种和综合利用垂直和水平两类抗性等。其中多系品种、聚合品种、品种组合及抗源品种的合理布局是在空间上实行抗病基因的多样化 ，减小病菌的定向选择压力，增强稳定化选择，防止毒性小种的优势化和传播蔓延，控制病菌群体的发展，从而得 以延缓或减轻病害的流行。而将具有不同抗病基因类型的品种轮换使用，则从时间上切断病菌的定向选择，控制病菌毒性新小种的发展。至于利用水平抗性品种和综合利用垂直和水平两类抗性的目的主要是同时发挥主效基因和微效基因两类基因的作用。生产实践证明，利用水平抗性品种和综合利用垂直和水平两类抗性是农田防锈中较为理想的方法，也是今后育种的一个重要方向。它的核心是以多抗病基因控制病菌多变，达到延长品种使用年限。其基础是明确所用品种抗性特点及遗传背景。 无论 采用 何种途径，要实现小麦品种抗条锈病基因的多样化， 均 需掌握有丰富的抗病基 因 和明确的抗源。 汪可宁（ 1988）曾指出，必须加强控制锈病 的基础研究，包括对重要抗源和生产品种进行基因定位分析研究，明确我国主要抗病基因类型，建立基因库，并转移到小麦生产品种中，促进基因合理布局，以不断提高控制小麦条锈病流行和危害的能力。 只有了解抗源的基因背景和抗病基因的特点，才能对其充分与合理地利用。使用抗病基因性质和特点不明确的抗源， 可能造成虽然品种的抗源 来源 不同 但 抗病基因 却 相同的抗病基因单一化应用和不合理布局。因此广泛收集抗源并对其抗病基因进行鉴别，了解不同抗病基因的遗传和表达特点，建立抗病基因 资源 库 ，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 有助于合理、有效地利用抗病基因。同时研究开辟和创制新的抗源，不断扩大与充实抗病基因库，为抗病品种的培育提供丰富的抗源和广泛的抗病基因选择余地。 1 小麦条锈病抗性遗传研究历史 1898 年，澳大利亚的 现小麦抗叶锈性是可以遗传的，揭开了小麦抗锈遗传研究的序幕。英国的 1905）开始了小麦品种的抗条锈性遗传研究，通过报道圆锥小麦“ 种对条锈病的抗性受控于一单隐性基因证明了植物的抗病性不仅是可以遗传的，而且符合孟德尔遗传规律。 1917 年，美国 次发现小麦秆锈菌有 生理专化现象，并建立了小麦秆锈菌标准鉴别系统，使运用科学方法通过有性杂交进行遗传分析成为可能。 1930 年， 道了小麦条锈菌的生理专化性，形成了明确的生理小种的概念。 1956）通过对亚麻 亚麻栅锈菌的研究，提出了基因对基因假说，在基因水平上阐述了寄主与病原物之间的相互作用 关系。此后 在其他专化性的病害中也证实了基因对基因关系的存在。这一理论对植物抗病性遗传和病原物的毒性及其变异的研究工作具有深远的指导意义。根据基因对基因学说，许多学者丰富和发展了基因推 导分析方法。 进入二十世纪中期，小麦的抗锈性遗传研究得到了进一步的发展。英国人 1962）对 7 个小麦品种从苗期到成株期都有效的基因进行了分析 鉴定，并提出了用 统来命名抗条锈基因。根据基因对基因假说， 1966）提出了生物间遗传学原理和不通过杂交推导寄主植物和病原物基因型的设想。 1971 年 进一步提出用高和低侵染型来描述寄 主和病原物的相互作用，只有当寄主中的低反应基因 lr(病原物中的低毒性基因 lp(作才呈现低侵染性（ 其它互作 lp/hr,hp/ hp/表现高侵染型（ 20 世纪 80 年代以来，分子遗传学和现代生物技术的兴起，使分子标记技术不断发展。由于分子标记技术能在基因型水平上定位抗病基因以及对作物种质资源进行深入评价和鉴定等，因而在植物抗病遗传分析中占有越来越重要的地位。如 980)用 经过近一个世纪的发展，植物抗病遗传研究也从中观向宏观和微观两个方向不断深入和发展。基因推导分析方法的发展和完善，使得人们能够了解大 区域、多品种的抗病基因状况；非整倍体分析、生化和分子 标记等技术的建立和发展，使人们能够在细胞和分子水平上认识抗病基因；常规遗传分析技术也不断完善，人们能够进行更为复杂的遗传分析。各种手段互有短长，互为补充。人们可以根据试验目的、试验条件等选择适合的方法。近年来，国内外利用各种方法测定了许多抗源和生产品种的小麦抗锈基因。其中包括常规杂交分析方法、非整倍体法、基因推导方法及基因连锁标记分析方法等。 2 小麦条锈病抗性遗传研究现状 麦抗条锈病基因的遗传分析与定位 目前国际上已正式命名了 30个小麦抗条锈病 主效基因位点的 33 个主效基因，即 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 其中 复等位基因； 成株抗条锈基因，其它 25个为苗期至成株期的全生育期抗性基因。除 上暂定名基因共 50余个，分别定位于不同的染色体上（表 1 表 1已知小麦抗条锈基因 in r 基因 起 源 抗性类型 S: 苗期 A: 成株期 显隐性 D: 显性 R: 隐性 染色体 位置 代表品种 代表品种（系） D 2A/266 D 7B D 1B D 1B 6 D 1B D 6B D 6B 6 D 2 R 7 D 2 D 2A/2D D 1B/1R D 1 D 1 D 2 D 2 D 7D 3R D/R 5B D 6D D 1 D 4D D/R 6D D 1 D 1D D 1 D 2 D 4 D 16 D 35 近几年来，又有一些新的基因被命名， 2003）等人用 结合部分连锁作图分析了由抗病品种 感病品种 杂交产生的 来源于 抗病基因定位于 2名为 且与 锁，并存在于许多 成的小麦品系中。 源于欧洲鉴别寄主 ， 2004）利用杂交 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 体进行 一个基因与 的抗性基因相同被定位于 2名为 基因还存在于北美鉴别寄主 2003）分析了杂交 名为 上述是已命名的抗条锈病主效基因，另外还有一些未正式命名的主效基因，它们中有些还没有被定位。这些基因包括： 能是多个基因的复合体）、 4B）、 6A）、 4B）、 4A）、 4A）、 1B）、 2B）等（见表 2）。 1986）推断品种 对基因控制，而这三个品种抗性都是部分隐性的。此外， 961)、 985,)、 986,1988,1992)、 981,1993,1995)、 1988,1990 ）、 988) 、 991,1992) 、 990,1993) 和992,1995)、 998)、何家泌、刘孝坤（ 1988， 1990）、舒文华（ 1990）、杨华安等（ 1990）、沈克全等（ 1991）、庞家智（ 1993,1994）、王凤乐（ 1994）、薛秀庄（ 1995）和徐世昌等（ 2001）也涉及到多个未知主效基因的研究。 麦条锈病抗病基因的分子标记 基因定位包括将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离这两个部分。传统定位所用的标记主要是基于形态标记和同工酶标记，这两种标记都是以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映。 80 年代以来，随着分子生物学技术的发展，出现了另一类 重要的遗传标记 子标记。 子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的，能反映生物个体或群体间基因组中 段的某种差异性，这种差异性经基因组切、 分子杂交后能被检测到。在遗传育种研究中每个与感兴趣的性状或目的基因连锁的多态位点称为一个分子标记。 子标记 具有以下优点：直接以 形式出现，没有上位性效应，不受环境和其他因素的影响；基因组 变异十分丰富，分子标记的数量几乎是无限的；表现为中性标记 ， 不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；有些分子标记(如 共显性标记，对选择隐性基因控制的农艺性状十分有利；通过对分子标记的深入研究还将最终达到分离、克隆并在 平上直接操纵有益基因的目的。 目前已开发了多种分子标记 。 依据多态性的检测手段，分子标记可分为：限制性片段长度多态性 (随机扩增多态性 扩增此段长度多态性 (简单重复序列 (序列标志位点标记（ 抗病基因类似物标记（ 分子标记（ 染色体原位杂交（ 异显示法 (D)等。在小麦 分子标记研究中，应用较多的是以上几种分子标记技术，应用这些技术标记了许多小麦抗条锈病基因（表 1 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 表 1麦抗条锈病基因的分子标记建立现状 of in 因 染色体 位置 分子标记的名称及种类 遗传距离 （ 作者姓名 及时间 1兰芬， 1999 1998 邵映田， 2001 51999 ， 1999 共分离 1999 渐新， 1999 个（ 7.7 .3 1999 2000 渐新， 1999 212000 P ， 2000 r2 2000 与 组值分别为 P 2002 B 共分离 2002 与 2003 1496761 分离 钟 鸣 ， 2002 P， 2003 分离 ， ,2002 X， ,2001 2 1997 3 植物抗病基因分子标记方法及应用 记 最早发展的分子标记，至今仍被广泛应用。其基本原理是利用限制性内切 酶酶切不同个体基因组 ，与同位素或非同位素标记的探针杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。 目前，小麦 7 个部分同源群的 传图谱基本构建完成，为定位和中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 标记小麦的目的基因提供了很大的方便。但由于小麦的遗传基础相对狭窄，小麦的 态性较低，在一定程度上限制了小麦 记在基因定位中的应用。 1995）用普通小麦与人工合成六倍体小麦杂种的单粒 传 14株系进行 抗条锈病基因 999)等用 到了与 叶锈病基因 抗秆锈病基因 分离的 记 且检测了上述基因在不同 王斌 （ 1995） 将其定位于水稻第 8染色体上，找到的 之连锁紧密，遗传距离为 用琏等 （ 1997） 人初步确定了与恢复基因 和 并且已经将 化为 记。 贾继增等（ 1993）用 记 将来自拟斯卑尔脱山羊草的抗白粉病基因位在小麦 ，纠正了以前用单体分析的方法将该基因定位于染色体 4A 上的错误。他们还发现了与该基因紧密连锁的生化 标记 其 子标记 。 然而 要的 较大，检测方法较为繁琐，周期长，多态检出效率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限。 记 术由 别 提出，是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物，通常为10 个核苷酸，以生物的基因组 模板进行 增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测 常规 应相比， 以下特点： 1)物是 1 个 10随机引物，常规 用 2 个 20右的特定设计引物； 2)应退火温度较低，一般在 36 左右，一方面保证引物与模板的稳定配对，同时允许适当的错误配对，提高多态检出率。 记检测灵敏、方便，多态性强，可以检测出 记不能检测的重复顺序区，可填补 谱的空缺，适用于种质资源鉴定和分类、目标性状基因的分子标记、遗传图谱的快速构建等研究。但是 记为显性标记，不能有效鉴别杂合子；易受反应条件的影响，稳定性较差。解决的办法之一是以测序扩增区段（ 记取代 对特异 带进行克隆并测序，以测出序列的一端 10 20 以 物的 10 成出寡聚核苷酸引物，以此引物进行基因组常规 增分析。 （ 1997）用近等基因系材料对来自野生二粒小麦的抗条锈病基因 行定位研究，从 340 个引物中共筛选到 6 条多态性的 记 带，其中 锁。以该特异带 探针和另一个 针（ 行 析，把 位在染色体 1点顺序为 组率分别为 用近等基因系材料筛选到了与抗条锈病基因 将其转化为稳定的 传距离为 牛永春等（ 1998）利用分离群体分组分析法在 380个随机引物中筛选到与小麦品种 锈基因紧密连锁的 红彦（ 1999）发现3 个与 序和引物设计转化成了 现 1 个与小麦抗条锈基因 传距离为 发现 2个标记 组率分别为 20%、 钟鸣（ 2000）对含有 行 了 现 记与 因具有连锁性； 中 第一章 绪论 7 记（ 经克隆、测序和引物设计转化为 et 1994） , et 1995） ; et 1996） 报道了与抗叶锈病基因 记 称为微卫星 由几个核苷酸（ 2 5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列如 (GA)n， (AC)n， (染色体上呈随机分布，由于重复次数不同及重复程度的不完全而造成了每个座位的多态性。 同一物种的基因型在微卫星侧翼区域有保守的 以 利用保守序列设计一对特异引物，扩增这个位点的微卫星序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可 显示不同基因型个体在这个 了用 还能以 以东方白松和火炬松为材料 , 直接以 探针调查了松属基因组微卫星 率 , 发现基因组中含量最丰富的核心序列是 (AC)n、(AG)n、 (n、 (n, 其 最小估计密度为每百万碱基对有 16 个位点。 记的特点是多态性强，随机均匀地分布于整个基因组，可通过 析引物序列公开发表，可以广泛交流使用，另外该标记还具有稳定性 好，多数显示共显性等优点。 被广泛用于 基因定位 、连锁图绘制及目标性状基因的分子标记等研究。 其 缺点是必须针对每个染色体座位的 定并找到其两端的单拷贝序列设计引物，无疑这需要投入大量的人力、物力 和财力。 近年来， 1997）用 一步用 （ 2002）找到一个与抗条锈基 因 记 与 遗传距离为 马渐新等（ 1999）用 找到了与其紧密连锁的 微卫星标记把农家种“和尚麦”中的抗条锈病基因 B 上。另外，王兰芬等（ 1999）直接选用 1B 染色体上的 2群体进行分析，确定1999）在对来自野生二粒小麦 选到了与 个 1个 胡英考等（ 2001）运用 53抗白粉病基因相连锁的 记 该基因定位于 5，标记与基因间的排列顺序为抗白粉病基因 姚占军（ 2003）用 记定位了中国小麦条锈病鉴别寄主 的抗病基因 找到了与其紧密连锁的 记 与 2 记 200 500 序列所界 定的位点 ， 在基因组中只出现一次。任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的界标转变为 它是 根据单拷贝的 段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组 而产生能够界定基因组的特异位点 (1989)。最富多中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 8 态性的 容易在不同组合的遗传图谱间进行标记转移 。 在人类基因组作图中已获得了 21000个 们是将遗传图谱和物理图谱整合的有力中介 (， 1996)， 这在基因组作 图上具有非常重要作用。 记 发明的