同型半胱氨酸对鸡胚早期心血管发育的影响.doc

同型半胱氨酸对鸡胚早期心血管发育的影响中华预防医学杂志 1999年第3期第33卷 论著作者：李勇李竹陈星齐佩文李松单位：李勇李竹陈星齐佩文李松（100083 北京医科大学中国妇婴保健中心）关键词：半胱氨酸；心血管畸形；叶酸；脱噬作用摘要目的探讨同型半胱氨酸与胚胎早期心血管发育的关系，了解叶酸和维生素B12是否能缓解同型半胱氨酸的心血管发育毒性。方法采用鸡胚孵化、电镜观察、甲基绿-派洛宁染色、原位DNA片段末端标记、叶酸和维生素B12的干预试验等方法。结果同型半胱氨酸（016.0 mol/胚胎）能干扰2天和4天龄胚胎心脏发育和血管分化，其作用随着剂量的增加而增强，呈剂量反应关系；8.0 mol/胚胎同型半胱氨酸诱发的心脏缺陷率分别为24.1和25.0，对卵黄囊血管的抑制率达60.7。4.0 mol/胚胎同型半胱氨酸能损伤心肌细胞及其细胞器结构，并抑制细胞DNA和RNA的合成。首次发现8.0 mol/胚胎同型半胱氨酸可诱导早期心肌细胞发生过度凋亡（2.7），明显高于正常对照组（0.08）。叶酸能拮抗同型半胱氨酸的心血管毒性，其效果大于维生素B12。结论同型半胱氨酸是一种新的能损害心血管发育的危险因素；叶酸能有效地拮抗同型半胱氨酸的发育毒性；细胞凋亡可能与心血管畸形的发生有关。 Effects of Homocysteine on Cardiovascular Development in Early Chicken EmbryoLI Yong，LI Zhu，CHEN Xing，et alNational Center for Maternal and Infant Health Care of China, Beijing Medical University，Beijing 100083AbstractObjectiveTo study the relationship between homocysteine （HCY）and cardiovascular development in the early embryo and to determine whether folic acid and cobalamine（Vit B12）can reduce the developmental toxicity of HCY to cardiovascular systemMethodsIncubation test for chicken embryo， electron microscopy，methylgreen-pyronine stain， in situ fragment end labeling，and intervention trial with folic acid and vitamin B12 were used in the studyResultsTreatment of 016.0 mol of HCY /per embryo could disturb their heart development and differentiation of blood vessels at fetal ages of two and four days，in a dose-response pattern，with 24.1% and 25.0% of heart defect and 60.7% of inhibition of blood vessels of yolk sac in 8.0 mol of HCY，respectively A dose of more than four mol/ per embryo could damage the structure of myocardial cells and organelle， and inhibit the synthesis of cellular DNA and RNA It was the first time to find that 8.0 mol of HCY could induce excessive apoptosis of myocardial cells（2.7%），significantly higher than that in the normal control groupFolic acid could antagonize the cardiovascular toxicity caused by HCY，stronger than what Vit B12 could doConclusionHCY was a new risk factor which could damage cardiovascular development，and folic acid could effectively antagonize its developmental toxicityCellular apoptosis might relate to cardiovascular defectKey wordsCysteineCardiovascular abnormalitiesFolic acidApoptosis近年大量研究发现，叶酸代谢障碍引起的高同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）血症是成人心血管疾病和出生缺陷疾病发生的重要原因之一1，2。目前认为，高HCY血症可能与先天性心脏病的发病有关，但对早期心血管发育是否有影响尚未见报道。我们对HCY是否能诱发原始心血管细胞死亡及细胞死亡的性质，补充叶酸和维生素B12是否能缓解HCY对心血管发育的损伤作用等问题进行了研究。材料与方法一、材料白色莱杭鸡种蛋由北京家禽孵化实验场提供，消旋-HCY、叶酸和维生素B12均购自美国Sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。主要仪器有透射和扫描电镜、光学和解剖显微镜、全自动孵化箱及开蛋器等。 二、方法1.鸡胚培养和分组：种蛋经1新洁尔灭清洗，分批入孵化箱，在相对湿度为60和温度为37.3的环境条件下培养，每2小时翻蛋1次。2天和4天后用照蛋器检出活胚，随机分7组；开蛋后分别进行卵黄一次性微量注射。各组注射新鲜配制的HCY剂量依次是0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mol/胚胎，对照组注射无HCY的PBS溶剂，注射体积为50.0 l/胚胎；继续培养2天后收获胚胎，镜检。2.组织病理检查：56只来自不同剂量的鸡胚经固定和石蜡包埋后，行6 m连续切片。以苏木精-伊红染色法显示胚胎组织结构,以甲基绿-派洛宁染色法显示DNA和RNA的变化3。3.电镜观察：按文献4的方法制备扫描和透射样本18例，分别观察心脏表面和内部细胞的超微结构。4.原位DNA片段末端标记（TUNEL）：按文献5进行。DAB-H2O2显色，甲基绿复染后封片和镜检。细胞核中有深棕色颗粒者为凋亡细胞，并按文献3的方法计数凋亡细胞百分率。5.叶酸和维生素B12干预实验：在确定HCY（8.0 mol/胚胎）能影响早期心血管发育后，对4天龄胚胎在注射HCY的同时给予叶酸（5 g/胚胎）和维生素B12（1 g/胚胎），再培养2天后观察干预效果。6.统计处理：全部数据应用SAS软件进行2和趋势性2检验。结果1HCY对早期胚胎心血管发育的影响：不同浓度HCY对2天龄和4天龄鸡胚心脏发育的影响见表1。HCY诱导的早期鸡胚心脏缺陷主要表现是心外露、心包积液、异位心和心脏发育过小（停滞在心球管期）。解剖镜下可见8.0 mol/胚胎HCY对卵黄囊血管分化有明显的抑制作用，抑制率达60.7（17/28），与对照组的3.7（2/54）相比差异具有显著性（表2）。表1同型半胱氨酸对早期鸡胚心脏发育的损伤(例数)同型半胱氨酸(mol/胚胎)2天龄4天龄活胚胎心脏缺陷*活胚胎心脏缺陷*例数百分率(%)例数百分率(%)例数百分率(%)例数百分率(%)042/4792.512.454/6287.111.90.544/4597.812.330/3293.8001.045/4795.712.234/4182.912.92.046/4895.824.338/5273.137.94.040/4883.3410.041/5180.449.88.029/4072.5724.140/5276.91025.016.018/3946.2738.916/4040.0637.5* 趋势性2检验P0.01表2叶酸和维生素B12对同型半胱氨酸发育毒性的干预效果(4天龄鸡胚)组别活胚胎心脏缺陷卵黄囊血管受损例数百分率(%)例数百分率(%)例数百分率(%)对照54/6287.11/541.92/543.7同型半胱氨酸(8 mol/胚胎)40/5276.90/4025.0*17/2860.7*叶酸(5 g/胚胎)12/1485.70*0*维生素B12(1 g/胚胎)12/1580.00*1/128.3*叶酸(5 g/胚胎)+同型半胱氨酸(8 mol/胚胎)17/2665.40*1/175.9*维生素B12(1 g/胚胎)+同型半胱氨酸(8 mol/胚胎)9/1752.91/911.10*与对照组比较P0.05，*与同型半胱氨酸组比较P0.052形态学观察：光镜下，2.0 mol/胚胎各组与对照组比较差异无显著性。4.0 mol/胚胎组可见心壁缺损和变薄，细胞排列紊乱；室间隔嵴发育不全；心包腔扩大；心脏小血管结构不清，数量亦明显减少。扫描电镜下，与对照组比较可见心脏表皮细胞受损，排列不整，相互嵌合处出现小的间隙，表面微绒毛减少或消失，重者细胞膜表面出现大小不一的空洞。透射电镜下，与对照相比可见心肌细胞固缩，肌丝减少和形态变异，线粒体不同程度肿胀和数量减少，空泡和髓样小体增多，未见闰盘和心房钠尿肽颗粒。首次发现凋亡细胞，表现为核仁分裂，染色质异常分布且呈团块和边缘化，典型者核呈“爆炸状分裂”。此外，在16.0 mol/胚胎组还发现大量坏死的心肌细胞。3甲基绿-派洛宁染色显示核酸变化：光镜下，正常心肌细胞发育良好，胞质（RNA）呈红色和核（DNA）呈绿色。8.0 mol/胚胎组，RNA和DNA着色变浅且核仁多不可见，表明HCY能干扰细胞核酸的合成。重者仅甲基绿阳性，此种心肌细胞已坏死；在某些正常细胞周围，可见单个存在的已变小和固缩的心肌细胞，其核绿色而胞质红色，此为凋亡细胞。4TUNEL检测：与对照组比较，8.0 mol/胚胎 HCY处理的心原基细胞凋亡发生百分率为2.7，明显高于正常对照的0.08（P0.05）。此外，在鸡胚头部、肢芽和鳃弓处亦观察到凋亡细胞。5叶酸和维生素B12干预试验效果：从表2可见，在注射8.0 mol/胚胎HCY的同时，补充叶酸能明显拮抗HCY对4天龄鸡胚心脏和卵黄囊血管的损害作用；维生素B12能拮抗HCY对卵黄囊血管的损害，但对其心脏损害无明显缓解作用。讨论目前虽尚未完全肯定高HCY与先天性心血管疾病之间的关系，但有报道表明，血HCY水平与出生缺陷性疾病高度相关6，7，HCY能诱发9天龄鸡胚发生心脏畸形8。本研究结果显示，HCY对2天龄和4天龄鸡胚心脏和血管发育有明显的损害作用，并呈剂量反应关系，进一步证明HCY是一种新的能干扰早期胚胎心血管发育的独立致畸物。细胞凋亡是细胞按时空顺序退变死亡的一种细胞行为，在胚胎形态（正常或异常）发生中具有重要作用。本实验应用多种方法发现，一定剂量的HCY能干扰DNA和RNA的合成，激发和促进心原基细胞凋亡过度，其凋亡发生率明显高于正常对照组。提示HCY诱导细胞凋亡而致的胚胎心肌细胞行为紊乱可能是心血管系统发生畸形的一个重要机制。反之，大剂量注射HCY（16.0 mol/胚胎）能诱发心肌细胞发生坏死，这可能是HCY导致胚胎早期死亡的基础之一。本研究还发现，HCY能明显抑制鸡胚卵黄囊血管的分化，其抑制率高达60.7，并对心脏血管结构有明显的破坏作用，上述损伤可造成胚胎血循环障碍和营养物质供给减少，这也是HCY致心血管系统发育异常的重要原因之一。大量流行病学调查证明，补充叶酸可明显减少神经管畸形的发生7。本干预试验发现，补充叶酸能明显缓解HCY对心血管系统的发育毒性，这就为用叶酸防治人类先天性心血管畸形的发生提供了初步实验证据；维生素B12能缓解HCY对卵黄囊血管的损害作用，但对HCY的心脏毒性拮抗不十分明显，提示维生素B12对胚胎心脏发育的保护作用小于叶酸，亦间接证明叶酸供给不足是产生高同型半胱氨酸血症的直接原因之一。*本研究受国家自然科学基金资助(编号：39730470)参考文献1Motulsky AG. Nutrional ecogenetics:homocysteine-related arteriosclerotic vascular disease, neural tube defects, and folic acid.Am J Hum Genet,1996,58:17-20.2McCully KS.Homocysteine and vascular disease.Nat Med,1996,2