蓝白斑筛选.doc

简介 蓝白斑筛选蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。 野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 编辑本段适用方面设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。X-gal只是半乳糖苷酶的作用底物,底物的量没有一个确定的值，只要底物的浓度足够显色就可以了，一般在培养基里，X-gal的终浓度是40ug/ml，IPTG的终浓度是24ug/ml，就可以显色，我们把这些直接涂在表面上，就更容易显色了，再多就有点浪费了天使托 (站内联系TA)直接往培养基中添加或者涂布的时候涂布也可以。lanbos (站内联系TA)在培养基里，我们课题组X-gal的终浓度是30-50ug/ml，IPTG的终浓度是0.8-1mM/ml，就是1ml培养基里加1微升IPTG。就可以显色.beautybanana (站内联系TA)IPTG的浓度为24mg/ml，x-gel的浓度为20mg/ml，倒到平板后，直接加IPTG 10ul和x-gel 20ul 涂抹均匀 避光保存，或者是1L的培养基里（高压灭菌冷却至60度，或是灭菌好的放在冰箱里的培养基加热溶化再冷却至用手摸着感觉不烫了）再加1ml IPTG和2ml x-gel，混匀后倒平板，避光保存（放在超净台上用干净的报纸遮挡起来）就可以了。 以下是我做菌液扩大培养的方法，希望对你能有帮助： 整个操作都在超净工作台中进行，超净工作台预先紫外灭菌15分钟。将长有蓝白斑的平板及灭过菌的菌液培养管放入超净工作台中，向每个培养管加入3ul的Amp及3ml的LB液体培养基（若LB培养基中已加Amp，则可直接加入管中）。用白枪头挑取白斑后直接打入培养管中，每个样品挑5个斑，尽量挑长在平板中间的、周围有蓝斑生长的的白斑，尽量避免挑的是假阳性。培养管盖盖前用酒精灯撩一下再盖盖。放入培养箱中过夜（大概16h),37度，200转.一、 1、蓝白筛选的原理 LacZ是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称互补。 如pUC系列的载体一般采用DH5、JM109。因为pUC系列的质粒具有lacZ的片段，而具有lacZM15基因型的DH5、JM109等能表达与片段互补的片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有-半乳糖苷酶活性。 当将具有互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。相反，不互补则产生白色菌落。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生互补，因此菌落是白色的。 从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。 2、影响转化率的几个重要因素 、受体细胞 转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。 此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于4的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。 、载体DNA和重组DNA方面 载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。 、操作方面 感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作均应在无菌条件下进行，所有器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有试剂也都要灭菌处理。 、转化体系中重组DNA的浓度与纯度 转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。 、外源基因与宿主染色体的同源性 外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易被宿主核酸酶降解而降低转化率。二、实验试剂X-gal：2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，-20保存备用），工作浓度20ul/20ml平板； 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/ml母液，置-20冰箱保存。工作浓度100ug/ml； IPTG：母液100mmol/L，-20冰箱保存。工作浓度40ul/20ml平板； LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%2%琼脂，灭菌后备用； 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后铺板； 大肠杆菌DH5a。 试剂的作用： X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）：一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物。 IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，它可诱导LacZ的表达。三、实验器具超净工作台；恒温水浴锅；制冰机；微量移液器；恒温摇床；常温离心机；恒温生化培养箱；冰箱；培养皿；玻璃刮铲。四、实验步骤、取4ul连接产物加入100ul感受态细胞中，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30min。 、将管置于水浴锅中42水浴热激90sec，立刻放置冰上5min。 、加入1ml 37预热的LB培养基，混匀。 、将管置于恒温摇床上37振荡培养1h。 、将管置于离心机中3000rpm离心5min。 、弃1ml上清，余下约100ul上清，用枪轻轻吹匀，用于涂板。 、在一含氨苄青霉素的LB平板上，加入20l 20mg/ml X-gal和40l100mmol/L IPTG。 、将玻璃刮铲过火灭菌后伸入培养平板中，待其冷却后均匀涂布平板，玻璃刮铲过火灭菌后置于酒精中备用，平板于室温放置30min备用。 、将前述所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上，用玻璃刮铲均匀涂布。将平板置于生化培养箱中正面放置30min后，再倒置，于37培养过夜。五、注意事项1、质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10。 2、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或