热点实验：WB,IH,IF,ICC实验.docx

【嘉美生物】即日起推出WB, IH, ICC, IF实验服务优惠活动，细则如下：1、嘉美生物提供原装进口抗体。我实验室进行实验服务有若干年的历史，因此我们实验室存有大批的国外原装抗体；意味着实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵（一般都会需要2000元以上）的一抗。2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。3、嘉美生物免费提供WB标本所需要的蛋白保护液。该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。4、实验委托者之需要提供样品，即可完成整个实验。WB实验服务案例一抗目的蛋白分子量稀释度公司/货号二抗稀释度Goat Rock1 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA，SC-6055Rabbit Anti Goat IgG/HRP1:40,000Goat Rock2 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA，SC-1851Rabbit Anti Goat IgG/HRP1:40,000Mouse GAPDH antibodyabout 37 kD1:800SANTA,SC-365062Goat Anti mouse IgG/HRP1:80,000注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。Fig 1：Lanes:Lane1Lane2Lane3Lane4Lane5Lane6Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)Rock1242.39337.97229.78233.16151.48205.53Rock2233.48219.11238.76191.61151.18203.66GAPDH160.18130.47141.06156.13147.77151.07样本编号253828232624WB操作规程一设备和试剂1设备 电泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323) 电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301) 电转仪及附件Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930) NC膜PIERCE，Catalog#88018 滤纸Whatman,3MM CHR2.试剂 凝胶试剂（实验室常备）试剂名称厂家30%丙烯酰胺溶液SIGMATris-BaseSIGMA10%SDSSIGMA10%过硫酸铵SIGMATEMEDSIGMATotal protein Extraction Kit ，ProMab美国，Cat. No：SJ-200501Renewable Buffer膜再生液，ProMab美国，Cat. No：SJ-200512天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract (M-PEK)，MERCK德国，Cat. No： 444810天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK德国，Cat. No：71183-3Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物中国，Cat. No：BRAKIT细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物中国，Cat. No：P1001细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物中国，Cat. No：P1003 常用溶液及缓冲液A5%积层胶所用溶液按总体积2.5ml：ddH2O：1.7ml30%丙烯酰胺溶液：0.42ml1.0mol/L Tris (PH=6.8)：0.315ml10%SDS：25ul10%过硫酸铵：25ulTEMED：3ulB分离胶溶液配方参考表C电泳缓冲液，1L3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10的储存液，在室温下长期保存。D电泳转移缓冲液,1L3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10的储存液，在湿温下长期保存。E5样品缓冲液,10ml0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4保存数周，或在-20保存数月。 二抗稀释液用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释。常用Secondary Antibody ：Rabbit Anti Goat IgG/HRP,嘉美生物, SEH0103,(1:10,00040,000)Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,00040,000)Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000100,000)Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 0001:10 000)二蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）A-1组织裂解提取总蛋白(采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )1)用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml 总蛋白提取液，匀浆5min20min直到组织充分破碎,然后冰上放置1020min后，再匀浆5min20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2)超声3次，每次3s。3)9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中4)-20冻存。A-2组织裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）1)确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。2)以下组织的处理应当尽快转移到 4无菌器皿中,如结缔组织,脂肪 血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3)轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4)组织碎块在100g 4条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5)加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。6)转移适当量的细碎切块 (可能冰冻的) 到一个预冷的匀浆器。 (最好是一个玻璃或石英制品)，向匀浆器中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取组织块。7)小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体 (例如 牛的肝脏需要10 下) ，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。8)尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。9)在16,000 x g和4 15 min条件下分离不能溶解的材料。10)丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11)放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。12)在16,000 x g和 4 15 min条件下 分离不能溶解的材料。13)使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。A-3组织裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)1)使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 体积，分装冻存于-20度(13107细胞用1ul/100)。2)所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3)取约120mg适量的冻存组织置于EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。4)将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。5)高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。6)4，16000g离心5min。7)移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。8)在絮状沉淀中加入1ul100Protease Inhibitor Coctail1ul100mM DTT75ulNucBuster Exaction Reagent 29)高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。10)4，16000g离心5min。11)将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70。B-1细胞裂解提取总蛋白(采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )1)细胞收集好，加入1ml 总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置1020minmin后，再吹5min20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2)超声3次，每次3s。3)9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。4)-20冻存。B-2细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）1)确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。2)将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3)轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4)在100g 4条件下离心2分钟， 小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5)加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。6)向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取细胞。7)小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。8)尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在 4 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。9)在16,000 x g和 4 15 min条件下分离不能溶解的材料。10)丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11)放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。12)在16,000 x g和 4 15 min条件下 分离不能溶解的材料。13)使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。B-3细胞裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)1)使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 体积，分装冻存于-20度(13107细胞用1ul/100)。2)所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3)将细胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。4)将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。5)高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。6)4，16000g离心5min。7)移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。8)在絮状沉淀中加入1ul100Protease Inhibitor Coctail1ul100mM DTT75ulNucBuster Exaction Reagent 29)高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。10)4，16000g离心5min。11)将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70。线粒体蛋白提取见附录1三蛋白浓度测定：由于采用内参照法校正，省略根据总蛋白浓度估算点样法。四SDS-PAGE电泳1)将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5loading buffer体积=5：1，混匀，在100加热三分钟以使蛋白质变性。2)设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大体积为25l,每个电泳道上样的最低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1g（考马斯亮蓝染色）-2ng（银染色）,最高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40g。3)把电泳装置与电源连接好，将电压调至200V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。4)从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。五免疫印迹操作-转膜1)将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.。2)带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR）和电转膜，滤纸和膜大小为83mm75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。3)打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。4)小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将电转膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。5)用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。6)将冰盒装入缓冲液槽，注满4预冷的转移缓冲液。7)将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移70min。8)电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，372小时或4过夜。六免疫检测一抗与靶蛋白的结合1)封闭的膜用PBST漂洗2-3次。2)将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条（一般为3 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。3)室温下于摇床孵育2h或4过夜。4)弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。酶标记二抗与一抗的结合1)根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。2)弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。七化学发光将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时，终止反应，用水清洗以去除不需要的背景。八根据实验要求可适当选择Werstern Bolt 膜再生显色法（采用Renewable Buffer膜再生液，ProMab，Cat. No：SJ-200512）1)在完成WB的显色或化学发光检测后，将蛋白转印膜置1PBS中漂洗5分钟。2)弃去1PBS，加入适量的WB膜再生液，至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗45min。3)弃WB膜再生液，加入1PBS在摇床上漂洗5min后，弃去1PBS，重复3次洗涤步骤。4)进行封闭等WB的后续操作。附录1：细胞线粒体分离实验步骤实验试剂：嘉美生物细胞线粒体分离试剂盒 产品编号：P1004试剂盒组成：目录