黄化突变体文献综述.doc

植物叶色突变体的研究进展植物叶色的表现受叶绿体中各种色素的综合影响, 正常情况下,由于叶绿素在植物色素总量中占优势而表现为绿色.叶色突变体是植物中突变率较高且易于鉴定的突变性状,往往直接或间接影响叶绿素的合成与降解,导致植株的叶片颜色较正常的绿色发生变化.目前几乎所有的高等植物中都发现了叶色突变体.(陈艳丽)在本世纪三十年代就有关于叶绿素突变体的报道,但叶色变异通常伴随着植株矮小,并影响植株的光合作用造成减产,甚至在生长过程中出现死亡现象,因此叶色突变体常被认为是无意义的突变.直到1949年,Granick对失绿的小球藻突变体的研究并通过此突变解释了叶绿素合成过程1，人们才认识到叶色突变体对理论研究具有重要的作用。并且最近几年，叶色突变体的研究越来越深入，也受到广泛的关注，已经被用于基础研究和生产实践，也取得了一定的成果。2叶色突变体的来源 除自然突变可产生叶色突变体外，利用人工诱变，插入突变和基因沉默等均可得到叶色突变，其中人工诱变和插入突变的突变频率较高。自然突变就是在自然条件不经过人工处理情况下发生的突变，比如自然辐射，环境污染等。但是自然突变的频率极低，一般不超过1%（郭龙彪，2006），因此可供直接利用的突变很少。我国著名水稻良种矮脚南特就是在高杆品种南特号稻田里发现的自然突变，水稻的叶色突变体chl1和chl9（zhang et al .2006），棉花中的芽黄突变体（蒋博2012），荠菜型油菜黄化突变体都是自发突变体。人工诱变人工诱变导致植物基因产生突变，是选育新品种、创造新种质的有效途径。根据产生诱变的来源，人工诱变分为物理、化学诱变及基因工程引起的突变，物理和化学诱变是主要的诱变方法。诱发植物发生突变的因素有诱变剂，物理诱变是通过各种射线（紫外线、X射线、丫射线、p射线、中子等）来处理植物某个器官（如种子、子房、愈伤组织等），诱发植物发生基因突变。种子是最常用的处理材料，其对环境适应能力很强，可以在极度干燥、低温、高温、真空等条件下进行处理，并且操作方便，便于运输和储藏。1934年日本首次利用X射线处理水稻种子，成功得到水稻早熟突变体（阳惠琴，1995）我国于1987年开始航天搭载育种利用空间环境（微重力、高真空、微磁场等）进行诱变，通过地面选育得到有益变异创造出新种质、培育出新品种，已经成功在水稻种选出紫色、红色、茶色等叶色突变体（萨如拉，2009）。化学诱变是通过烷化剂、叠氮化钠、碱基类似物等对植物进行诱变，其中烷化剂是诱变效率最高和最常用的化学诱变剂。常用的烷化剂又包括甲基黄酸乙酯（EMS）、磺酸二乙酯、乙烯亚铵和亚硝基乙基脲。EMS诱变得到的突变体大多数为点突变，诱变机理：EMS带有1个或多个活性烷基，该基团能够转移到其他电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基,可以改变氢键的能力,从而DNA在复制时导致碱基配对错误而引起突变。EMS将鸟嘌呤的O6位置烷基化，在DNA复制过程中由于烷基化的鸟嘌呤与正常的胸腺嘧啶配对，使得碱基发生替换（赵用亮，1996）。EMS诱发的另外一个鸟嘌呤位点是N7位点，该位点是最易起反应的位点几乎可以与所有烷化剂起烷化作用，鸟嘌呤N7位点烷基化后，使核苷键发生水解导致断裂，鸟嘌呤从DNA链上脱落，造成DNA链碱基缺缺失，在复制的时候游离的碱基可能发生错配，以致发生碱基颠换即G：CA：T，G：CC：G，G：CT：A；另外烷基化的鸟嘌呤易离子化，使稳定的酮式变为不稳定的烯醇式，不与胞嘧啶配对而与胸腺嘧啶配对，从而发生G：CA：T转换。除此之外，EMS还可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键，使得DNA双链交联而造成变异甚至死亡。这些DNA结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活，而表现出被掩盖的性状。另外胸腺嘧啶O4位点也易发生烷基化，其次是鸟嘌呤N3，腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3位点，此四个位点发生烷基化后引起碱基置换突变只占烷化作用突变的10%。1.1.2叶色突变体的分类由于叶色突变体通常在苗期出现叶色变异,因此,其分类常常根据苗期的叶色表型进行。目前分类方法较多,如Gustaftsson把叶色突变体分为五种类型：白化、黃化、浅绿、条纹、斑点。而Awan等将其分成八种类型：白化,黄化,浅绿,白翠,绿白,黄绿,绿黄和条纹。二者的分类中,白化、黄化、浅绿类型相同,Awan将条纹和斑点两种类型按表型的差异又分成了不同的类型16。walles将叶色突变体分成3类:1、单色突变,指叶片仅表现出浅绿、黄、白三种颜色中的一种;2、杂色突变,指叶片存在多种颜色,如白黄、白绿、斑等;3、阶段性失绿,指在植株发育的某个阶段,叶色发生突变,然后再恢复到正常颜色。然而,简单地以苗期表型为依据来进行分类具有一定的局限性。植物的表型性状与基因型并非一一对应的关系,一种表型性状可能受多个基因同时突变的共同影响,即使是同一个基因发生突变,损伤的程度不同基因功能也会表现出不同的表型性状。比如,au和yg一2是番茄的黄叶突变体,其表现型非常相似,而研究表明an突变体的黄叶性状是由编码血红素加氧酶的基因发生突变引起的,yg一2突变体中编码光敏色素生成团合酶基因发生了突变17。另外,还有一些叶色突变性状在苗期时无法识别,如常绿(staygreen)突变体是常见的苗期后才表达的叶色变异18,此突变性状也存在于拟南芥、菊花等很多物种中,其最明显的特征是生育末期叶片保持绿色甚至出现完全不黄化现象。植物表型的表达不仅受基因的控制,也受环境因素的影响。因此,在对叶色突变体进行分类时,应根据不同的表型性状选择并结合多种分类方法对其进行科学的分类。1.1.3叶色突变体的遗传研究叶色突变体的来源广泛,种类繁多,种类不同其遗传规律差别也较大。叶色变异性状可能受细胞核遗传,也可能受细胞质遗传;可能由单基因控制,也可能由多基因控制;可能是质量性状,也可能是数量性状。为了确定叶色突变的遗传方式,在构建F1群体时必须进行正反杂交,并且需要进行测交试验。如果是细胞质遗传,正反杂交的子代叶色表型不同,总是和母本保持一致且不发生性状分离;如果是细胞核遗传,正反交的子代叶色相同,在F2和BC1群体中发生叶色分离,并具有一定的性状分离比例,根据分离比便可知叶色变异是受单基因控制还是多对基因控制。甘蓝型油菜黄化突变体的基因定位3.1细胞核遗传对多种突变体的研究表明,叶色突变多是由单隐性核基因控制的13、19、20、21。胡远辉等对甘蓝型油菜叶色突变体Cr3529进行了研究,认为此突变性状受细胞核内1对隐性基因控制22。刘海衡等对芥菜型(召rassicajuneea五.)油菜黄化突变体五“s少进行了研究,该黄化性状受2对隐性核基因控制23。何瑞锋等(2000)研究“斑马叶”叶色突变体,发现由于核基因改变其叶片间断失绿24。吴殿星等对水稻转绿型白化突变系W25进行研究,表明W25不育系的的叶色表型由单隐性核基因控制。253.2细胞质遗传细胞质遗传的叶色突变体与细胞核遗传的相比,数量比较少,且后代性状遗传以母性遗传方式进行。细胞质控制的叶色突变体最早在大豆中出现,刘友杰利用激光诱变处理早稻品种,获得了褪绿突变体,遗传分析表明该褪绿性状是由细胞质基因突变引起的26。此外,受细胞质遗传的叶色突变体仅在拟南芥27、小麦28(王保莉等,1996)、烟草15、29(Mondeetal.,2000;Baraketal.,2001)等植物中有报道。1.1.3.3外部环境对叶色突变体的影响外部环境如温度、光照,水分等对叶色突变体都有影响,其中温度的影响最大。陈佳颖等(2010)利用60c。丫射线辐照处理粳稻品种嘉花1号的种子,得到了1个低温敏感叶色突变体InrZI,在较低温度(25.0)条件下,该突变体幼苗叶色呈黄色;随着温度逐渐升高,叶色由黄色转化为绿色,出现转化现象的临界温度约为27,5。301.1.4叶色突变体的分子机制叶绿素合成机制的稳定受突变基因直接或间接的影响,任何妨碍叶绿素素代谢稳定性的因素都会引起叶色变异,其分子机制非常复杂。1.1.4.1叶绿素生物合成途径中的基因突变叶绿素合成分为厌氧条件和有氧条件下的反应。的生物合成以谷氨酸与a一酮戊二酸为原料,然后合成厌氧条件下,高等植物叶绿素ALA。2分子ALA成1分子胆色素原,其具有毗咯环。4分子胆色素原经脱氨基缩合形成脱水缩合形成1分子尿琳原11，尿叶琳原111的4个乙酸侧链脱梭形成具有4个甲基的粪叶琳原m。在有氧条件下,粪叶琳原m再脱梭、脱氢、氧化形成原叶琳双,原叶琳IX是形成叶绿素和亚铁血红素的分水岭。如果与铁结合,就生成亚铁血红素;与镁结合,则形成Mg-原叶琳仄。Mg一原叶琳IX的一个梭基被甲基酷化,在原叶琳IX上形成第五个环,接着B环上的一CH=CHZ侧链还原为一CHZ一CH3,即形成原叶绿酸酷。原叶绿酸酷经光还原变为叶绿酸酷a,然后与叶醇结合形成叶绿素a,叶绿素b是由叶绿素a转化而成的。叶绿素合成的过程涉及多个酶的参与。DVR基因最先被鉴别后,参与高等植物叶绿素合成的所有基因逐一被鉴定,拟南芥中从谷氨酞一tRNA到叶绿素b的合成过程中,共有编码15种叶绿素合成酶的27个基因参与困31agatactal.,2005)。叶绿素合成过程中的任何一种酶的合成发生突变均可影响叶绿素的合成进程,进而改变叶绿体中各种色素的含量,引起植株叶色变异。1.1.4.2血红素代谢途径中的基因突变叶绿素合成速率受细胞内血红素含量影响。当血红素的消耗大于合成时,血红素减少就会促进ALA的合成,ALA含量增加促使叶绿素的合成。当血红素的合成大于消耗时,其浓度升高从而抑制ALA的形成,ALA含量减少便抑制叶绿素的合成。血红素经一系列的反应最终形成光敏色素生色团,若此途径任何反应受阻,细胞内血红素含量上升,血红素的积累反馈抑制叶绿素合成,突变体由于缺乏叶绿素使得叶色产生变异17。叶绿素合成过程中血红素反馈抑制是关键的调控步骤。最直接的证据是,在番茄aurea和yenow一green一2突变体中,编码血红素氧化酶(hemeoxygenase)和光敏色素生色团合酶的(PFBs”thase)基因突变,使细胞内积累过量的血红素,其反馈抑制叶绿素前体氨基酮戊酸的合成,致使突变体表现为叶色黄化17。1.1.4.3编码其他叶绿体蛋白的基因突变叶绿体的结构基础是蛋白质,约占口卜绿体干重的30一40%。它亦是叶绿体功能的基础,几乎参与叶绿体全部的生命活动,如酶代谢过程中的催化剂、负责翻译的核糖体等,它们的主要成分均为蛋白质。电子传递链是由蛋白质与细胞色素、质体蓝素等相结合而构成的,对叶色起关键作用的光合色素同样需要与蛋白质结合形成复合体而存在,同时叶绿体内膜系统的主要成分也是蛋白质32,33(Kalmangara,1988;Yaronskaya,2003)。一些叶绿体蛋白的突变可导致叶绿体内部膜结构发育不完全,进而叶绿素及其他光合色素的合成及稳定性也受到影响,最终使叶绿体中各种色素的含量及比例发生改变34(June,1969)。叶绿体基因和细胞核基因共同编码叶绿体中的蛋白质,其中大约80个叶绿体蛋白质由叶绿体基因组编码,而3000多个蛋白由核基因编码,在细胞质中合成后通过叶绿体外套上的异位子进入叶绿体中35、36(sat。,1999;Gray,2003)。此外谷氨酞一tRNA还原酶催化叶绿素合成的第一步反应,而叶绿体核糖体的突变直接影响谷氨酞一tRNA还原酶的合成,减少叶绿素的含量33(Yaronskaya,2003)。叶绿体膜转运蛋白的突变可能阻碍叶绿体膜对蛋白及酶的识别、结合和转运,从而使叶绿素合成速率降低37。1.1.5叶色突变体表型与叶绿素含量的关系叶色突变体的叶绿素含量发生变化，影响植株的光合作用，从而影响植株的多种生理活动。叶色突变体在植物生理研究中的应用已经很广泛，比如通过叶色突变体研究叶绿素生物合成、叶绿体分化与发育、光合作用和光形态建成等基础研究，尤其是对植物光合作用和光形态建成的研究中，叶色突变体是理想的材料。叶片是植株进行光合作用的场所，叶色突变往往影响植物光合效率。郭春爱等利用水稻低叶绿素b突变体研究了低叶绿素b对突变体光系统II热稳定性的影响15。结果表明，低叶绿素b突变体对高温更敏感，PS II捕光色素蛋白复合体(LHC II)中叶绿素b减少可能降低了PS II结构与功能的热稳定性。光敏色素由生色团和蛋白质两部分组成，是植物光形态建成的光受体。光敏色素生色团生物合成受阻，其含量降低将反馈抑制叶绿素合成，引起对光不敏感的叶色突变16。生色团含量影响光敏色素活性，其含量降低，光敏色素的活性也随之下降17，因此可利用生色团缺失的突变体研究光敏色素在光形态建成中的作用。叶色突变体除可直接或间接影响叶绿素合成外，亦可影响激素的合成，改变突变体内源激素含量。比如脱落酸(ABA)，其生物合成途径中的基因突变，可直接导致ABA含量的下降，突变体的生长发育便受到一定程度的影响，造成叶色突变18；脱落酸生物合成的起始反应在叶绿体中进行，因此叶绿体的发育状况直接影响其合成是否能顺利进行，叶绿体发育异常可影响脱落酸合成中关键酶的活性，降低突变体的脱落酸含量19。1.1.6叶色突变体的应用价值目前很多农作物如水稻、油菜、小白菜、辣椒等都有关于叶色变异作为标记性状鉴定杂交种字纯度的报道。水稻中,余新桥等(2000)利用淡绿叶色标记性状的突变体,培育出带淡绿色叶色标记的不育系:标一IA,标一IA与中413、明恢63的杂交后代均表现出较强的杂种优势。曹立勇等(1999)将紫叶标记转育到釉型光温敏核不育系中,通过筛选培育出中紫S。油菜中,赵云等(2003)利用物理和化学诱变复合处理,获得了幼叶黄化突变性状Cr,将其突变性状和核不育性状同时导入到油菜PolCMS中,成功地选育出了带Cr标记的双低双重不育三系。1.1.7.2叶色变异可应用于高光能育种的研究叶绿体是植物进行光合作用的场所,光合作用的效率受叶绿素含量、叶绿体形态、结构和数目变化的共同影响。叶色突变不仅会影响叶绿素的含量,而且对叶绿体的分化和发育也有影响,因此,叶色突变体是研究光合作用的理想材料。Gan等(1995)利用转基因技术在烟草中获得了一个常绿突变体,此突变体在生长末期叶片持绿时间较长,衰老过程明显延迟,且能有效的吸收光能,延长光合作用的时间,其生物量增加40%、种子产量增加52%,从而使实现高光效育种变得可能。光抑制是植物在强光下光合作用受到抑制的现象。当同时出现其他环境胁迫因素如低温,高温和干旱等时,光抑制会加剧。一些黄化突变体,虽叶绿素含量减少,但叶黄素含量明显较多,叶黄素在植物体内以紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质三种状态相互转化,使光系统避免伤害。如在水稻“249黄”突变体中,虽叶绿素含量减少,但光合结构对强光的耐受性升高,突变体的最大光合速率反而显著上升(龚红兵等,2001)。1.1.7.3叶色突变体可作为改良作物品质性状的资源叶色突变体叶绿素含量的改变,对植物的生长一般具有负面的影响。但少数的叶色突变体使得植物具有特殊优良品质。安吉白茶的返白现象与温度有较大的关系。返白和复绿的过程中,叶绿素和类胡萝卜素含量均是由低到高变化,但氨基酸总量的变化却是随白化程度的加深而升高,氨基酸总量高峰值可达5%,有很高的营养价值。在烟草中,叶片缺少叶绿素也有特殊的利用价值。烟草叶绿素缺乏变异型分为白肋型、灰黄型、黄绿型等,其中白肋突变体来源于马里兰深色晒烟,叶绿素含量还有一些叶色突变体的颜色比较特殊,可培育成观赏植物。Oud等(1995)利用转基因植株进行多年相互杂交实验,培育出了橙色的矮牵牛新品种7.4叶色突变体在功能基因组学研究中的应用功能基因组学是指利用结构基因组学研究得到的大量数据与信息评价基因的生化、细胞、发育和适应等功能,其主要方法结合了高通量、大规模统计和计算机分析技术。目前已有多种分析验证基因功能的方法,其中突变体是最为有效的分析方法。吴自明等(2007)对水稻叶绿素合成缺陷突变体进行研究,并利用图位克隆方法克隆了该基因(YGLI)。对其基因功能研究表明,该基因编码叶绿素合成酶,其催化叶绿素a生物合成过程中的最后一步反应。Jung等(2003)利用T-DNA插入的方法获得水稻黄绿色突变体,经研究发现,T-DNA的插入改变了基因OsCHLH的结构,该基因最大的一个亚基一CHLH亚基C末端缺失,从而导致镁鳌合酶的活性降低,使该突变体叶绿素合成受阻,表现出黄绿色的表型。刘文真(2006)等利用T-DNA插入法获得了对低温敏感的水稻叶色突变体,对该突变体的研究将更好的了解温敏叶色突变的分子机制。7.5叶色突变体在植物生理研究中的应用叶色突变体的叶绿素含量发生变化,影响植株的光合作用,从而影响植株的多种生理活动。叶色突变体在植物生理研究中的应用已经很广泛,比如通过叶色突变体研究叶绿素生物合成、叶绿体分化与发育、光合作用和光形态建成等基础研究,尤其是对植物光合作用和光形态建成的研究中,叶色突变体是理想的材料。叶片是植株进行光合作用的场所,叶色突变往往影响植物光合效率。郭春爱等(2007)利用水稻低叶绿素b突变体研究了低叶绿素b对突变体光系统11热稳定性的影响。结果表明,低叶绿素b突变体对高温更敏感,PSll捕光色素蛋白复合体(LHCn)中叶绿素b减少可能降低了PsH结构与功能的热稳定性。光敏色素由生色团和蛋白质两部分组成,是植物光形态建成的光受体。光敏色素生色团生物合成受阻,其含量降低将反馈抑制叶绿素合成,引起对光不敏感的叶色突变(Terryetal.,华中农业大学2011届硕士研究生学位论文1999)。生色团含量影响光敏色素活性,其含量降低,光敏色素的活性也随之下降,(welleretal.,1997),因此可利用生色团缺失的突变体研究光敏色素在光形态建成中的作用。叶色突变体除可直接或间接影响叶绿素合成外,亦可影响激素的合成,改变突变体内源激素含量。比如脱落酸(ABA),其生物合成途径中的基因突变,可直接导致ABA含量的下降,突变体的生长发育便受到一定程度的影响,造成叶色突变(Agrawaletal.,2001);脱落酸生物合成的起始反应在叶绿体中进行,因此叶绿体的发育状况直接影响其合成是否能顺利进行,叶绿体发育异常可影响脱落酸合成中关键酶的活性,降低突变体的脱落酸含量(Fambrinietal.,2004)。1.2叶色性状基因定位方法1.2.1质量性状基因定位方法质量性状指能观察而不能测量的性状, 即属性性状,它表现出质的中断性变化。因此在相对性状间呈现非连续变异, 其遗传上由一个或少数几个效应大的基因(或称主基因)决定, 受环境影响较小, 因而能对群体内的个体进行明确的分类。对多种突变体的研究表明，叶色突变多是由单基因控制的。胡远辉(2004)等对甘蓝型油菜叶色突变体Cr3529进行了研究，认为此突变性状受细胞核内1对隐性基因控制20。刘海衡等对芥菜型油菜黄化突变体L638-y进行了研究，该黄化性状受2对隐性核基因控制21。何瑞锋等研究“斑马叶叶色突变体，发现由于核基因改变其叶片间断失绿22。吴殿星等对水稻转绿型白化突变系W25进行研究，表明W25不育系的的叶色表型由单隐性核基因控制23。1.2.2 数量性状基因定位方法常用的数量性状基因定位方法有单标记分析法、区间作图法、复合区间作图法、多重区间作图法等。(1) 单标记法（single marker analysis）包括标记分析方法（marker-based analysis）和性状分析方法（trait-based analysis）两种，前者利用每个标记位点不同基因型和性状存在的差异，通过传统的单因素方差分析法，检测数量性状在标记基因型间的差异是否显著，并进行F测验，若结果显著，则说明该标记位点可能与一个或多个QTL(quantitative trait locus)连锁。这种方法简单且符合QTL定位的基本统计原理，同时不需要完整的分子标记连锁图。性状分析方法的原理是假设由于选择的结果使数量性状的高、低表型间等位基因增减频率改变，当QTL等位基因与某一标记基因连锁时，由于其相互关联，导致高、低表型个体间标记基因频率的差异。(2)区间作图法(Interval mapping, IM)是由Lander和Botstein、Jensen和Knapp等提出的，其原理是利用饱和连锁图谱，通过极大似然函数和线性回归模型对目标性状进行全基因组扫描，判断是否存在任意相邻标记位点和位点间任一位置上具有对该性状有效应的位点64-66。各个位点对性状的效应大小通过似然值（LOD值）来衡量，根据似然值绘制的曲线图可以确定QTL在染色体上可能的位置。(3)复合区间作图法(Composite interval mapping, CIM)由Zeng提出等，是在区间作图的基础上发展起来的,该方法的原理是：检测某一特定标记区间时，将与其它QTL连锁的标记也包括在模型中以控制背景遗传效应，实现了同时利用多个遗传标记信息对基因组的多个区间进行多个QTL的同步检测，是目前应用最为广泛的方法之一67。复合区间作图法的主要优点是：保留了区间作图法的优点，利用QTL似然图来显示QTL的可能位置及显著程度；一次只检验一个区间；若不存在上位性和环境互作的影响，其位置和效应的估计是接近无偏的；利用了整个基因组的标记信息；以所选择的多个标记为条件，控制了背景遗传效应，提高了作图的精度和效率。复合区间作图法存在的主要问题有：若存在上位性及QTL与环境互作等复杂的遗传学问题则结果会出现偏离；需要从大量的标记中筛选出部分有用的标记，而筛选时采用的显著性水平以及筛选的方法均会影响定位结果；由于拟合在模型中的标记会吸收其附近的QTL效应，复合区间作图法需要为检验的区间开辟一个窗口，窗口内的标记不能包括在模型中，但适合的窗口大小不易确定68。 (4)混合线性模型方法由朱军提出，该方法把群体均值、QTL的各项遗传主效应作为固定效应，而把环境效应、QTL与环境互作效应、分子标记效应及其与环境的互作效应以及残差作为随机效应，将效应估计和定位分析结合起来，进行多环境下的联合QTL定位分析，提高了作图的精度和效率69。Yang和Zhu开发了可以分析包括加性和加加上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应的计算机软件,这种模型可以无偏地分析QTL与环境的互作效应，并可以扩展到分析具有加加、加显、显显上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应的QTL 70。1.3分子标记技术1.3 分子标记技术 基因定位主要是通过分子标记来定位性状位点，通过寻找与目标性状连锁的分子标记，再计算分子标记与位点间的重组率，最终将基因定位在染色体的具体位置，分子标记技术有很多种，包括传统的分子标记技术和新兴的分子标记技术。1.3.1 传统的分子标记技术遗传标记，从形态标记、细胞标记、生化标记，逐步发展到分子标记，其中传统的分子标记技术包括： RFLP标记技术、RAPD标记技术、AFLP标记技术和SSR标记技术，其中又以SSR标记技术应用最为广泛。简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 标记又称微卫星（Microsatellite）标记，是第二代分子标记，一般以16个核苷酸为单位，经过多次串联重复而形成的DNA序列。当重复单位发生不同次数的重复或不完全重复时，会影响扩增片段大小，导致该位点具有多态性。以基因组中某一特定微卫星两侧的保守序列为依据，设计引物，经PCR扩增及凝胶电泳分离，扩增产物长度上的变化即可揭示SSR位点的多态性71。相关研究表明SSR广泛分布于植物整个基因组，包括其编码区和非编码区，平均23.3Kb就有一个SSR72，SSR序列在不同植物基因组中的分布具有很大差别73，SSR序列在以水稻为代表的单子叶植物基因组中多出现高G+C含量的重复类型，原因是其基因组中富含碱基G和C，而在双子叶植物油菜中则多于出现高A+T的SSR序列74。SSR 序列在遗传过程中极不稳定，因此多态性丰富，其高度多态性主要表现在基本串联单位数目变化极大。SSR核心序列的碱基组成和重复次数在不同的物种或同一物种的不同基因型间是随机的，导致了SSR长度的高度差异性75。正是由于这些差异性导致了SSR 标记的产生。相对于基因组非重复区域，SSR序列的突变速率极高，在不同物种、不同位点间其突变速率差别很大 76-78 。造成SSR序列不稳定的因素很多，主要包括SSR位点总长度以及组成SSR序列的各重复单元长度两个因素79-80。研究表明影响SSR序列突变率的最主要因素是SSR位点长度，随重复单元数目的增加SSR序列突变速率加快81。SSR标记优点在于：SSR标记长度差异大，多态性丰富82；SSR标记呈共显性，可用于鉴别纯合子与杂合子83；引物是根据特定的保守序列设计的，重复性好且很稳定。SSR标记也有其缺点：SSR引物需根据SSR位点两端的序列设计，当某一物种的DNA序列未知时则不能获得。1.3.2 SNP分子标记技术单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 是美国学者Lander在1996年提出的第三代遗传标记，指的是由于单个碱基的转换、颠换、插入或缺失造成的DNA序列的多态性84。SNP标记广泛分布于动植物基因组中，且数量巨大85，但在不同物种以及基因组的不同区域出现的频率不同。在人类基因组中大约在人类基因组中大约1000bp出现1个SNP86，在拟南芥中的频率是1/500bp87, 在水稻中, Nasu等和Subbaiyan等发现SNP出现的频率分别是1/232bp和1/147bp88-89，在大豆基因组中为1/438bp90。在甘蓝型油菜中，每600个碱基对有1个SNP, 1Gb左右的油菜基因组中大约有170万个SNP，大多数SNP在非编码区91。SNP标记分析方法有多种类型，其中具有代表性的包括单链构象多态性、酶切扩增多态性、高分辨熔解曲线分析等低通量的传统检测方法以及中高通量的SNP芯片检测方法92。单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism, SSCP) 是最早应用于等位基因分型，其原理是单个碱基出现差异造成单链DNA构象发生改变，从而导致单链DNA在凝胶中的电泳迁移率不同。利用SSCP进行SNP分型主要限制在于DNA片段的长度，片段越长，单碱基差异引起的电泳迁移率差别越小。SSCP基因分型方法耗时较长，操作繁琐，对聚丙烯酰胺凝胶要求较高。在甘蓝型油菜中，李媛媛利用该技术，以SI-1300和Eagle为材料，对10对功能基因的序列之间的差异进行多态性分析，发现在不同材料之间甘蓝型油菜功能基因序列高度保守，其遗传变异类型主要来源于SNP93。酶切扩增多态性序列法 (cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS) 的主要原理是，基因组中存在一些可能导致酶切位点发生改变的SNP，通过设计特异性引物对目标SNP在基因组DNA进行扩增，然后对PCR扩增产物进行酶切，再通过电泳以检测。CAPS操作简单、适用成本低，但其不适合大量SNP检测。高分辨熔解曲线法 (high resolution melting, HRM) 的基本原理是通过双链DNA熔解曲线的变化来反映核苷酸性质的差异94。HRM具有分辨率高、快速、安全、操作简单的特点，但是，由于HRM分辨能力极高，其对温度及PCR体系的要求也极为严苛，而且对于单碱基SNP而言，只能较好地检测出G/C与A/T之间的变化；如果PCR扩增区域里SNP位点过多，也会干扰HRM分型结果。SNP芯片以其集高通量、高集成、微型化和自动化等优点成为检测SNP的新的优良手段，其原理是将固定在载体上的密集的寡核苷酸探针阵列与所要检测的目标DNA进行等位基因特异性反应，根据反应后信号的有无和强度大小确定SNP位点。大规模、高通量SNP芯片检测最先应用于人类群体遗传学研究中，并在人类关联性分析上取得很大进展95。SNP芯片也被应用于一些家畜全基因组关联分析、QTL定位及候选基因筛选96。1.3.3 SNP芯片技术在油菜中的应用目前广泛采用的SNP芯片主要有两类，分别由美国 Affymetrix和Illumina公司开发，而在油菜中所采用的SNP芯片主要是Illumina公司的微珠芯片。Illumina芯片有GoldenGate和Infinium两大系列产品。GoldenGate芯片近年来已应用于芸薹属作物遗传作图和多样性等研究，例如在白菜中，用含384个SNP的GoldenGate芯片对来自栽培种“chiifu”和“kenshin”的DH群体以及野生种、栽培种进