奶粉中非蛋白氮污染物的快速检测.doc

重庆大学本科学生毕业设计（论文）奶粉中非蛋白氮污染物的快速检测学 生：张境学 号：20077109指导教师：李苹专 业：生物工程重庆大学生物工程学院二O一一年六月Graduation Design(Thesis) of Chongqing UniversityNon-protein nitrogen formula for rapid detection of pollutantsUndergraduate: Zhang JingSupervisor: Prof. Li Ping Major: Biological EngineeringCollege of Biological EngineeringChongqing UniversityJune 2011重庆大学本科学生毕业设计（论文） 中文摘要摘 要本文以三种不同奶粉为原料，通过向奶粉中梯度添加以三聚氰胺为代表的奶粉中非蛋白氮污染物，制成含低，中，高浓度三聚氰胺的样品；设计了一种快速且经济的检测以三聚氰胺为主的奶粉中非蛋白氮污染物的方法来检测样品中的非蛋白氮污染物。该方法结合了凯氏定氮法和考马斯亮蓝G-250比色法，通过对实验数据的比较和处理，再结合相关文献已有的数据，得到三聚氰胺的回收率。在奶粉中三聚氰胺含量检测结果比较成功的基础上，对三聚氰酸及其他非蛋白氮污染物的检测进行系统的分析和讨论。本文同时还对采用凯氏定氮法和考马斯亮蓝G-250比色法测定乳制品中蛋白质含量进行了比较研究，对实验中采用的主要分析方法，凯氏定氮法的试剂加量、消化过程、消化时间等分析条件进行了优化。实验结果表明：a奶粉中中等浓度三聚氰胺（1000mg/kg）和高浓度三聚氰胺（2500mg/kg）的回收率均为分别为89.98%和99.85%，相对平均偏差（RSD%）分别为8.51和6.36.b奶粉中中等浓度三聚氰胺（1000mg/kg）和高浓度三聚氰胺（2500mg/kg）的回收率均为分别为90.73%和95.05%，相对平均偏差（RSD%）分别为11.70和5.51。c奶粉中中等浓度三聚氰胺（1000mg/kg）和高浓度三聚氰胺（2500mg/kg）的回收率均为分别为94.48%和95.05%，相对平均偏差（RSD%）分别为12.75和7.21。关键词：乳制品，非蛋白氮污染物，三聚氰胺，凯氏定氮，考马斯亮蓝G-250III重庆大学本科学生毕业设计（论文） 目录 ABSTRACTIn this paper, three different milk powder are raw material,by adding melamine in the gradient to milk samples with low,medium and high concentrations of melamine .Design a fast and economical method to test melamine contamination in milk powder-based method to detect melamine in the samples;The method combines the Kjeldahl method and Coomassie brilliant blue G-250 ,by processing and comparing the experimental data ,and combined with existing data literature,to get the recovery of melamine.Test results of melamine in milk powder is successful,then analysis and discussion of the detection of cyanuric acid.It is compared Kjeldahl with Coomassie brilliant blue G-250 determination of protein content in dairy products in this paper.To analyse and optimization method experiments, and Kjeldahl method of reagent dosage, and the digestive process,and conditions such as digestion time.The result shows that:The recovery rates of melamine in powdered milk(a)that contains moderate and high concentration melamine (1000mg/kg and 2500 mg/kg ) are 89.98% and 99.85%,and the relative average deviation (RSD%are 8.51)and 6.36.The recovery rates of melamine in powdered milk(b) that contains moderate and high concentration melamine (1000mg/kg and 2500 mg/kg ) are 90.73% and 95.05%,and the relative average deviation (RSD%)are 11.70and 5.51.The recovery rates of melamine in powdered milk(c)that contains moderate and high concentration melamine (1000mg/kg and 2500 mg/kg ) are 94.48% and 95.05%,and the relative average deviation (RSD%)are 12.75and 7.21.Key words: dairy products,melamine, Non-protein nitrogen pollutants, Kjeldahl Method, Coomassie Brilliant Blue G-250 目 录中文摘要ABSTRACT1 绪言11.1三聚氰胺和三聚氰酸的简介11.2三聚氰胺和三聚氰酸的毒性21.3由三聚氰胺引起的食品安全事故31.4 三聚氰胺等奶粉中非蛋白氮被添加到乳制品中的原因41.5 乳制品中三聚氰胺等非蛋白氮污染物污染的来源分析51.6 常见的乳制品中三聚氰胺检测的方法61.6.1 HPLC法和LC法61.6.2 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）61.6.3 GC-MS和GC-MS/MS法71.6.4 ELISA法71.6.5 表面解吸常压化学电离质谱(DAPC I-MS)71.7 研究意义和目的71.8 研究的主要内容82材料与方法92.1主要仪器和试剂92.1.1 主要仪器92.1.2 主要试剂及试剂配制92.2 实验原理102.3 分析方法112.3.1 样品的制备112.3.2 考马斯亮蓝G-250比色法测量蛋白质含量112.3.3 凯氏定氮法测样品总氮123 实验结果与讨论153.1 样品中蛋白质含量的测定153.1.1 蛋白质标准曲线153.1.2 奶粉样品中蛋白质含量测定的准确度和精密度163.1.3 小结173.2 用凯氏定氮法测定样品中的总氮173.2.1 奶粉样品中总氮的测定173.2.2 小结193.3 考马斯亮蓝G-250法和凯氏定氮法测量蛋白质含量的比较193.4 样品中三聚氰胺含量测定213.4.1 b、c奶粉样品中三聚氰胺的测定213.4.2 a奶粉样品中三聚氰胺的测定223.5用此方法检测三聚氰酸的可行性分析及推广233.5.1 三聚氰酸危害性分析233.5.2三聚氰酸的检测的可行性分析233.5.3试验方法的推广价值243.6凯氏定氮法的分析条件讨论243.6.1 消化过程243.6.2 蒸馏过程254 结论与展望264.1 主要结论264.2 展望26致谢28参考文献29 重庆大学本科学生毕业设计（论文） 1 绪言1 绪言近年来频繁爆发乳制品安全事故，奶粉中非蛋白氮污染物的含量成为乳制品安全的重大问题，其中尤以三聚氰胺为甚。2008年以三聚氰胺为主要非蛋白氮污染物的的奶制品污染事件是中国大陆爆发的一起重大食品安全事件。事件起因是很多婴儿被确诊患有肾结石，调查发现他们都食用过三鹿集团生产的婴幼儿奶粉，进一步检测确定奶粉中含有化工原料三聚氰胺。根据官方公布的资料，截至2008年9月21，因食用三鹿婴幼儿奶粉而接受门诊治疗的婴幼儿累计39,965人，正在住院的有12,892人，已治愈出院1,579人，死亡4人。与此同时中国国家质检总局对外公布国内的乳制品厂家生产的婴幼儿奶粉的三聚氰胺的检验报告，该事件进一步升级，包括伊利、蒙牛、光明、圣元及雅士利在内的22个厂家69批次产品中都检出三聚氰胺。该事件对中国食品商品的信誉造成及其恶劣的影响，多个国家禁止了进口中国乳制品1。虽然事件已经过去三年，但其产生的影响还没有退去，2011年中国中央电视台每周质量报告调查发现，仍有超过7成中国民众不敢买国产奶。以三聚氰胺为主的奶粉中非蛋白氮污染物含量成为中国消费者关心的重要内容。鉴于三聚氰胺的危害，本文主要以其为例进行奶粉中非蛋白氮污染物的研究。1.1三聚氰胺和三聚氰酸的简介三聚氰胺（英文名：Melamine），是纯白色单斜棱晶体，无味，密度为1.573g/cm3 (16)，也是重要的氮杂环有机化工原料。俗称蛋白精，学名2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺1 2。化学式为C3H6N6，相对分子质量126.15，化学分子结构见图1.1图1.1 三聚氰胺的化学分子结构三聚氰胺在水中溶解度随温度升高而增大,在20时，约为3.3 g/L，即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于多种有机溶剂等1。三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等1。三聚氰酸（英文名：cyanuric acid），略有苦味的无色无臭晶体，白色结晶。约在330解聚为氰酸和异氰酸3。从水中析出者含有2分子结晶水，相对密度1.768（0），在空气中失去水分而风化，从浓盐酸或硫酸中析出者为无水结晶。中文名称:为三聚氰酸；1,3,5-三嗪-2,4,6-(1H,3H,5H)三酮；S-三嗪-2,4,6-三醇；氰尿酸；异氰脲酸；2,4,6-三(2-羟基-4-正丁氧基苯基)-1,3,5-三嗪；对称三羟基三氮杂苯；2,4,6-三羟基-1,3,5-三嗪，分子式:是C3H3N3O3 ，分子质量为129.07，化学结构见图1.2图1.2 三聚氰酸的化学结构式三聚氰酸溶于热水、热醇、吡啶、浓盐酸及硫酸而不分解，也溶于氧化钠和氢氧化钾水溶液，不溶于冷醇、醚、丙酮、苯和氯仿3。三聚氰酸是一种重要的化用原料，常用于合成氯代衍生物，三氯异氰尿酸等；亦可以用于合成氰尿酸-甲醛树脂；还可以作为抗氧剂、涂料、粘合剂、农药除草剂。1.2三聚氰胺和三聚氰胺毒性目前三聚氰胺被认为具有轻微毒性，大鼠口服的半数致死量大于3克/公斤体重。据1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的国际化学品安全手册第三卷和国际化学品安全卡片也只说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石1。美国食品药品管理局(FDA)食品安全高官史蒂芬桑德洛夫表示，研究发现，在食品中只有同时含有三聚氰胺和三聚氰酸这两种化学成分时才对婴儿健康构成威胁。 三聚氰胺和氰尿酸虽然只有低急性毒性，但有证据显示在同时摄入三聚氰胺和氰尿酸后，会导致肾毒性。研究人员试验了大鼠单独摄入三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺或三聚氰酸一酰胺（均为三聚氰胺类似物），三聚氰胺和氰尿酸的混合物，以及这四种化合物的混合物。三 聚氰酸二酰胺或三聚氰酸一酰胺单独均未对肾产生任何作用，但混合物则产生了明显的肾损伤，并在肾单位中形成晶体。分析证实了肾中三聚氰胺和氰尿酸的存在13。三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。 这看来虽然三聚氰胺和三聚氰酸共同作用下才会导致肾结石，但是三聚氰胺在胃的强酸性环境中会有部分水解成为三聚氰酸，因此只要含有了三聚氰胺就相当于含有了三聚氰酸，其危害的本身仍源于三聚氰胺4。三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，在动物体内新陈代谢很快而且不会存留，主要影响泌尿系统。 三聚氰胺量剂和临床疾病之间存在明显的量效关系。三聚氰胺在婴儿体内最大耐受量为每公斤奶粉15毫克。专家对受污染婴幼儿配方奶粉进行的风险评估显示，以体重7公斤的婴儿为例，假设每日摄入奶粉150克，其安全预值即最大耐受量为15毫克/公斤奶粉。 2011年4月6日卫生部等5部委发布规定：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。1.3由三聚氰胺引起的食品安全事故近几年由于三聚氰胺造成的食品污染事件层出不穷，国家和社会予以高度重视。2007年，美国爆发宠物食品受污染事件，造成大量宠物因食用不合格饲料死亡。调查表明：小麦蛋白粉中掺杂三聚氰胺含量超过6.6%，宠物因食用以此为主要原料的食品导致中毒5。 2007年深圳检验检疫局检验出从台湾进口的3批“爱族牌”观赏鱼饲料含有三聚氰胺，且三聚氰胺含量较高，分别为0.35 g/kg 、0.47g/kg 、0.51g/kg。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，大量婴幼儿因食用受污染奶制品换上肾结石，经调查研究发现罪魁祸首也是三聚氰胺6。 2009年12月，阳泉市金福来乳业有限公司利用鲜奶和顶账回来的过期奶粉加工成26吨奶粉，在未检测的情况下将该奶粉销往湖南、河北等地，该奶粉三聚氰胺含量严重超标，该案涉案区域广，社会影响极大。阳泉市郊区公安分局依法逮捕该公司法定代表人兼总经理王志刚等7名涉案犯罪嫌疑人。1.4 三聚氰胺等奶粉中非蛋白氮被添加到乳制品中的原因由于我国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷，不法商人常将三聚氰胺等非蛋白氮掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标。 在我国通常用凯氏定氮法检测食品和饲料中蛋白质的含量。凯氏定氮法是在在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量。但此方法只有在样品中氮全是蛋白氮才可以准确的测出，而不法商家正是利用这一点，以此冒充蛋白氮1。蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16%左右，而三聚氰胺的含氮量为66%左右，其他非蛋白氮物质含氮量也远高于蛋白质。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。通常用来检测蛋白质的方法是“凯氏定氮法”，通过测出样品的含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，所以食品中添加三聚氰胺会使测得的蛋白质测试含量虚高，以便使劣质食品和饲料在检验机构做粗蛋白质检测时达到标准，进而流入市场。据估算在植物蛋白粉和饲料中为使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。而且三聚氰胺无色无味，加入食品中不易被发现，这使其成为很便利的有害食品添加剂。 此事件的主要责任方三鹿官方给出另一种解释为，企业加入的是尿素，而原奶在高温下直接变成奶粉，高温使得尿素发生脱水反应，生成三聚氰胺，因此最终产出的奶粉中含有三聚氰胺。不过无论如何，其用不法手段提升奶粉中蛋白质含量的做法都是对人民生命健康的不负责任。1.5 乳制品中三聚氰胺等非蛋白氮污染物的来源分析根据调查研究发现以三聚氰胺为主的奶粉中非蛋白氮污染物主要通过以下途径加入到奶粉中，主见图1.26：图1.2 三聚氰胺进入乳制品的途径根据图表进一步对这几种途径进行深入分析：根据各种资料显示三聚氰胺可以从途径进入。奶牛食用含有三聚氰胺的饲料，经过生理消化吸收过程虽然一部分三聚氰胺排出体外，但同样有一部分残留在奶牛体内，进而通过奶牛泌乳进入鲜奶中。据新闻媒体报道，在饲料加工企业将三聚氰胺加入到饲料中以提高饲料粗蛋白含量比较普遍，可以说此途径是三聚氰胺污染的一个来源。形成这种现状的原因，主要是饲料加工生产行业激烈的不正当竞争所致，由于饲料生产加工是低技术含量行业，企业很难通过正常运作获取利润，有时甚至亏本经营，而向饲料中添加三聚氰胺等奶粉中非蛋白氮可以提高饲料质量增加产品竞争力，所以造成假蛋白饲料泛滥6。有研究表明，将尿素添加到奶牛饲料可以提高饲料的粗蛋白质含量。原因是尿素溶解度很高,在奶牛瘤胃中的微生物的作用下能迅速转化成氨,进而合成非必须氨基酸。因此适当的添加对奶牛是有利的。但三聚氰胺可以在生物体内经酶系统催化转变成三聚氰胺，可以说也是一种隐害。三聚氰胺以可以从途径进入乳制品。即三聚氰胺在鲜奶或乳制品加工过程甚至加工后加入到了乳制品。在途径中主要是奶农向鲜奶中添加三聚氰胺和奶贩子加入三聚氰胺者两种途径，他们加入三聚氰胺的原因，可能是奶质本身不好为达成交易加入的三聚氰胺；也可能是向兑水后鲜奶中加入三聚氰胺以提高蛋白质的检测值，牟取非法利益。途径是发生在乳制品的生产过程中。这主要是因为个别黑心厂家为了以次充好获取暴利，向奶粉中添加三聚氰胺，再用比市场价格低的价格卖出，从而占领市场，以获得非法利益。通过途径这个途径主要是个别经销商或不法分子为获取非法利益而加入三聚氰胺。无论是什么原因，向乳制品中添加有害物质，都是违法的行为，都应当受到道德的谴责和法律的制裁。这次事件给了我们深刻的教训，使得整顿规划乳制品行业势在必行，也戳破了“国家免检产品”这一光环背后的黑暗，使政府和人民认识到食品安全来不得免检。1.6 常见的乳制品中三聚氰胺检测的方法和研究中的新方法经过多年的研究，乳制品中三聚氰胺的检测方法有很多种，常见的有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱法（LC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱质谱联用法（GC-MS）等2。近年来随着对乳制品中三聚氰胺检测方法提出更高要求，很多科研单位投入其中，研究出很多新型方法，例如酶联免疫吸附测定法、表面解吸常压化学电离质谱(DAPC I-MS)等,但这些方法也存在灵敏度低和特异性弱的问题，有待进一步研究7。1.6.1 HPLC法和LC法789高效液相色谱法是我国颁布的检测乳制品中三聚氰胺的权威检测方法之一。详见2008年10月7日实施的原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法（Determination of melamine in raw milk and dairy products）即GB/T 22388-2008的第一法。该方法的检测是用1%三氯乙酸和分析纯乙腈提取三聚氰胺并沉淀蛋白质，通过阳离子交换萃取柱净化后用高效液相色谱测定，同时作出标准曲线，用外标法定量，本法的定量限为2mg/kg.在2008年10月15日颁布的原料乳中三聚氰胺快速检测-液相色谱法(Rapid determination of melamine in raw milk-High performance liquid chromatography method)即GB/T22400-2008主要叙述说明液相色谱法来检测原料乳中三聚氰胺的含量。该法采用乙腈作为蛋白质沉淀剂和三聚氰胺的提取剂，用强阳离子交换色谱柱分离，最后用高效液相色谱-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，用外标法定量。本法的检测范围为0.30mg/kg-100mg/kg，定检测限为0.05mg/kg。1.6.2 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）2910液相色谱-质谱/质谱法是GB/T22388-2008中提到的第二法，同时也是美国食品药品管理局（FDA）于2008年10月发布的Determination of Melamine and Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS中采用的方法。LC-MS/MS法的原理是用三氯乙酸溶液提取样品中的三聚氰胺，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，同样也是采用外标法定量。本法的定量限为0.01mg/kg。1.6.3 GC-MS和GC-MS/MS法12气相色谱质谱联用法是GB/T22388-2008中的第三法。该方法的原理是试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。GC-MS法的定量限是0.05mg/kg,而GC-MS/MS法的定量限达到了0.005mg/kg。1.6.4 ELISA法29酶联免疫吸附测定法是利用抗体与三聚氰胺，三聚氰胺酶标记物特异性结合，通过颜色变化，测量吸光值，进而计算出结果的方法。 利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。 根据颜色深浅进行数据读取。依据标准的吸光度值得出样品中三聚氰胺的的浓度值。根据资料显示，三聚氰胺的最低检测灵敏度可达0.2ppm。1.6.5表面解吸常压化学电离质谱(DAPC I-MS)2表面解吸常压化学电离质谱(DAPC I-MS)是近年来研制成功的新型质谱快速分析方法,能够在没有样品预处理的情况下对固体、粉末等复杂基体样品中的痕量待测物质进行快速检测。给方法由于利用空气中的水蒸气作为电离试剂,无须使用高压气体、甲醇或甲苯等有毒试剂,分析过程清洁无害且不对样品造成污染,还具有分析速度快、灵敏度高、特异性好等特点。以上方法都具有检测灵敏度高的特点，可以精确地测定乳制品中含量极低的三聚氰胺，国家级以及省市级的质量检测中心以及各大型的乳制品生产厂商采用上述方法可以很容易测定三聚氰胺的含量。但是几十万上百万一台的设备对于很多中小乳制品加工企业是一个不小的负担。而根据各方面数据显示低剂量的三聚氰胺毒性很小，在实际生产中往往不需要检测的定量限达到微克级，所以研究廉价高效的检测方法很有市场前景，这不仅利于加强食品安全也可以极大促进经济发展。1.7 研究意义和目的111213三鹿奶粉事件爆发以前，很多种小型乳制品生产厂商采用凯氏定氮法来检测牛奶中的蛋白质含量。在事件爆发后，由于国家标准的改变这些仪器不能符合检测要求，很多都搁置起来。有鉴于此，如果能把这些仪器利用起来，再结合其他一些仪器设备，设计一种快速经济的检测乳制品中以三聚氰胺为主的奶粉中非蛋白氮污染物的方案，这样不仅解决了这中小企业和地方质监部门无力承担高昂的检测费用的问题，也解决了奶粉中非蛋白氮污染物的初检测问题，为奶制品安全把好关。本课题通过凯氏定氮法和紫外/可见光分光光度法联用，并对两种方法测得的氮的结果进行分析，通过数据比较计算奶粉中非蛋白氮的含量。有鉴于三聚氰胺的危害性，本实验以其作为主要检验目标。之后通过实验结果分析，推断以三聚氰酸为检验目标的可行性，进而推广到其他奶粉中非蛋白氮污染物的鉴定。如果该方法可行，那么采用国产紫外/可见光分光光度计和半自动凯氏定氮仪联将节省大量成本，有利于基层质监部门和中小企业乳制品安全检测。本实验设计原理简单易行，具有普遍适应性。可以检测多种奶粉中非蛋白氮含量。也可以及时发现新型非蛋白氮添加剂，为奶粉检测提供预警。1.8 研究的主要内容1112本课题以三聚氰胺为例对奶粉中非蛋白氮污染物进行研究。通过向三种不同奶粉中梯度添加三聚氰胺，制成含低，中，高浓度三聚氰胺的样品。之后用凯氏定氮法对样品进行总氮量的测定；同时采用考马斯亮蓝G-250染色，在595nm波长下测定奶粉样品中的蛋白质吸光度，然后将两种方法的数据换算成蛋白氮，通过对这两部分实验数据的比较和分析，结合相关文献，计算三聚氰胺的回收率和相对标准偏差。以此确定本实验的分析方法是否达到分析要求。在实验符合预期的基础上，分析用此种方法测量三聚氰酸的可行性，进而推广到其他奶粉中非蛋白氮的检测。最后对凯氏定氮法中试剂的加量，消化和蒸馏的时间等分析条件进行了分析讨论和优化。7重庆大学本科学生毕业设计（论文） 2 材料与方法2 材料与方法2.1主要仪器和试剂2.1.1 主要仪器紫外/可见光分光光度计UV-1100：深圳市凯铭杰仪器有限公司制造；KDN-04、08型定氮仪：上海精隆科学仪器有限公司制造；MolecularH2O纯水仪：重庆摩尔水处理设备有限公司制造；电子分析天平；2.1.2 主要试剂及试剂配制样品奶粉a：雅士利慧能金装婴儿配方奶粉（900g）（蛋白质含量12-18%），广州雅士利集团有限公司制造。产品标准号为Q/YSLR32，生产日期为2011年01月02日；样品奶粉b：贝因美冠军宝贝俱乐部幼童奶粉配方4阶段（908g）（蛋白质含量18%）制造商宜昌贝因美食品科技有限公司。产品标准号为Q/HBS079,生产日期为2011年01月13日；奶粉样品c：雀巢全脂奶粉Nespray（900g）（蛋白质含量24%），商标持有人为瑞士雀巢产品有限公司，为中国黑龙江省双城雀巢有限公司制造。产品标准号为Q/NSL004，生产日期为2010年12月01日。硫 酸： 分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂生产；盐 酸： 分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂生产；磷 酸： 含量85%（W/V），重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂生产；硼 酸： 分析纯，重庆博艺化学试剂有限公司生产；30%过氧化氢：重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂生产；医用乙醇： 体积分数为95%，重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂生产；三聚氰胺： 分析纯，成都科龙化工试剂厂生产；氢氧化钠： 分析纯，成都科龙化工试剂厂生产；无水碳酸钠：分析纯，成都科龙化工试剂厂生产；硫酸钾： 分析纯，重庆北碚化学试剂厂生产；五水硫酸铜：分析纯，重庆北碚化学试剂厂生产；甲基红指示剂：分析纯，浙江省温州市东升化工试剂厂生产；溴甲酚绿指示剂：分析纯，上海试剂三厂生产；牛血清白蛋白：上海国药集团化学试剂有限公司生产；考马斯亮蓝G-250：成都科龙化工试剂厂生产。主要试剂的配制：标准蛋白质溶液：精确称取牛血清白蛋白50mg，加蒸馏水水溶解并定容至100ml,用移液管吸取上述溶液20ml,用蒸馏水稀释定容至100ml，即得到100g/ml的标准蛋白质溶液。 考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝G-250粉末，溶于25ml95%的医用乙醇中，再加入50ml85%（W/V）的磷酸，用蒸馏水定容至500ml。即得到所需的溶液，该溶液在常温下可保持30天。 40%NaOH溶液：精确称取40g分析纯NaOH，用蒸馏水溶解，待冷却后定容到100ml即可。 0.6% NaOH溶液：精确称取6g分析纯NaOH，用蒸馏水溶解，待冷却后定容到1000ml即可 2%硼酸溶液：精确称取2g分析纯硼酸，用蒸馏水溶解并定容至100ml即可。 0.1%甲基红指示剂：精确称取50mg分析纯的甲基红粉末，用95%医用乙醇溶解并定容至50ml即可。 0.1%溴甲酚绿指示剂：精确称取50mg分析纯的溴甲酚绿粉末，用95%医用乙醇溶解并定容至50ml即可。 混合指示剂：1份上述0.1%甲基红指示剂和5份上述0.1%溴甲酚绿指示剂临用时混合即可。 0.05mol/l盐酸标准液：先配置成浓度近似的盐酸溶液，然后用无水碳酸钠标定。具体标定方法：称取0.20g无水碳酸钠，用约20-30ml蒸馏水溶解，加入1-2滴混合指示剂，用配置的盐酸溶液滴定至暗红色为终点。由此得出盐酸溶液的浓度。计算公式为：式中： N所标定的盐酸的浓度单位为mol/l； m称量的无水碳酸钠的质量单位为g； V滴定所用盐酸溶液的体积，单位为ml。 106碳酸钠的分子质量。本次实验所配制的盐酸标准液的浓度为0.052mol/l。2.2 实验原理不含非蛋白氮污染物的的乳制品中氮的分布一般分为蛋白氮和非蛋白氮两部分，其中绝大部分为蛋白氮。凯氏定氮法能比较精确的得出所测样品中的总氮量，但是却无法分辨蛋白氮和非蛋白氮。利用考马斯亮蓝G-250染色后进行比色是测量样品中蛋白质含量的一种常用方法，该法的准确度和精确度也都比较高。本次实验是基于上述两点来设计的。原理是利用凯氏定氮法得出样品中的总氮，用考马斯亮蓝G-250比色法测出样品的蛋白质含量，换算成氮含量，比较这两个数据，再结合牛奶中常见非蛋白氮的量进行分析，就可以得知非蛋白氮污染物的含量。本实验用三聚氰胺作为非蛋白氮污染物。2.3 分析方法2.3.1 样品的制备 奶粉 参照国家质检总局在2008年9月16日发布的含三聚氰胺乳制品中所示的三聚氰胺浓度，确定按照表2.1制备梯度添加了三聚氰胺的奶粉样品.表2.1：梯度添加三聚氰胺的奶粉样品的制备样本号奶粉加量（g）三聚氰胺加量（g）三聚氰胺浓度a-11000.01100mg/kga-21000.11000mg/kga-31000.252500mg/kga-410000b-11000.01100mg/kgb-21000.11000mg/kgb-31000.252500mg/kgb-410000c-11000.01100mg/kgc-21000.11000mg/kgc-31000.252500mg/kgc-4100002.3.2 考马斯亮蓝G-250比色法测量蛋白质含量 标准曲线的制作取六支试管，分别编号，按照表2.2加入试剂摇匀，三分钟后用10mm玻璃比色皿在595nm波长下测量吸光度，以吸光度为横坐标，蛋白质含量为纵坐标绘制标准曲线。表2.2：蛋白质标准曲线的制备试剂管号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0考马斯亮蓝G-250试剂（ml）555555蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白质含量（g）020406080100 测定蛋白质含量1） 奶粉 精确称取奶粉样品a-1 0.1g，用10ml0.6%NaOH溶液溶解，从此溶液中吸取4ml，用0.6%NaOH溶液定容至100ml。对奶粉样品a-2、a-3、a-4、b-4、c-4重复上述步骤。取干燥试管6，将定容后的样品0.6ml分别加入其中，之后各加0.4ml蒸馏水，以及5ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置3分钟后，用10mm玻璃比色皿在595nm波长下测量吸光度12。做不少于三次平行测定。2.3.3凯氏定氮法测样品总氮参照GB/T5009.5-2003,对奶粉样品和鲜奶样品进行凯氏定氮13。1） 消化样品以表1中四个样品一组分别称取0.5g，置于4个干燥的消化管中，均分别加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾和约15ml浓硫酸，摇匀。将装有式样的消化管移在消化架上，套在装有密封圈的排气管上将消化管稍加旋转，使连接处保持密封良好，再装上弹簧夹。手握排气管，连同装有式样的消化管一起移至消化炉上，使消化管在电炉中心位置，消化管底部离电炉底10mm左右。接通电源开启开关将温度调制450消煮20min左右，见有大量棕黄色气体冒出，此时带上手套，将排气管连同消化管一起取出，置于消化管架上冷却，打开排气管上部瓶塞，逐个向消化管内加入2-3mlH2O2后，将温度调至300，重新消煮5min，仍用上法，向消化管内滴加H2O2直至消化液呈蓝色透明，再移入消化炉，继续消煮15min（此时温度为450），待消化管冷却至室温，将消化后的液体转移至100ml容量瓶内，用蒸馏水定容至100ml。另取与上面相同量的硫酸钾和硫酸铜，加入相同量的浓硫酸，不加样品做空白试验。2） 蒸馏 根据KDN-04、08型定氮仪使用说明书连接仪器。样品蒸馏前，先插上电源、拨动电源开关、接通电源。然后打开自来水龙头。（排水阀处于关闭状态）使自来水流入机内冷凝管，然后从出水口排出。按水泵键蒸馏水由水泵抽入蒸汽发生炉内，蒸馏水达到所设置水位，即自动停止进水，蒸发炉自动进入加热状态。待2分钟后，水加热沸腾达到蒸汽状态，蒸汽即从机体左侧上部橡胶管中喷出。即可置入需要蒸馏的消化管，和三角接收瓶（在250ml三角接收瓶中加入2%H3BO3和2-3滴混合指示剂），然后按碱泵键按钮注入碱液（40%NaOH）。再按蒸汽键按钮转换蒸汽电磁阀通道，使蒸汽入消化管内进行蒸馏。蒸馏约6-7分钟接收瓶液面达到150ml时，将接收瓶下移，使接收瓶离开滴管口，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后释放蒸汽按钮，蒸馏结束随即取出消化管，取下接收瓶待滴定之用。蒸发炉内水位将至进水位置，即又自动进入进水状态，并继续加热。按上述方式进行下一个样品蒸馏。3） 滴定 用已经标定好的盐酸标准溶液滴定接收瓶中的液体至变为红色为终点，记下读数。空白样亦照此操作。4）计算按照式1进行计算。计算公式： （式1）式中：X试样中氮含量，单位为g/100g；v2滴定样品时所需标准酸溶液体积，mL；v1滴定空白样品时所需标准酸溶液体积，mL；c盐酸标准溶液浓度，molL；m试样质量，单位为g；V试样消化液总体积，mL；V试样消化液蒸馏用体积，mL；0.0140与1.0mL盐酸标准溶液（1.000molL）相当的氮的质量，单位以g表示。13重庆大学本科学生毕业设计（论文） 3 实验结果与讨论3 实验结果与讨论3.1 样品中蛋白质含量的测定按照2.3.2中的方法检测了奶粉样品的蛋白质含量。其中，根据奶粉包装上标称的蛋白质含量对b、c奶粉样品计算了回收率和相对标准偏差；对a奶粉样品计算了相对标准偏差。3.1.1 蛋白质标准曲线按照表2.3加入试剂摇匀，三分钟后用10mm玻璃比色皿在595nm波长下测量吸光度12，记录于表3.1。表3.1：蛋白质标准曲线的测定编号蛋白质含量（g）吸光度（A）100.0002200.1773400.3074600.4365800.54161000.632以蛋白质含量（g）为纵坐标，吸光度为横坐标，作出蛋白质标准曲线，见图3.1. 采用最小二乘法拟合数据得到的蛋白质标准曲线方程为：y = 157.78x - 5.0378（式2）。计算相关系数r=0.9937，显示正相关性很强；相关指数r2=0.9874，显示方程的回归效果很好。3.1.2 奶粉样品中蛋白质含量测定的准确度和精密度按照2.3.2中所示方法对奶粉样品a-1、a-2、a-3、a-4、b-4、c-4进行吸光度测定，做三个平行测定。带入3.1.1中的回归方程，计算出蛋白质的含量和回收率以及相对偏差。结果如表3.2、3.3：表3.2：奶粉样品中蛋白质含量测定的相对标准偏差样品号吸光度（Abs）蛋白质含量相对标准偏差（RSD%）a-10.23813.55%算术平均：13.44%0.110.23613.42%0.23513.34%a-20.23413.28%算术平均：13.26%0.170.23613.42%0.23113.08%a-30.23613.42%算术平均：13.28%0.140.23413.28%0.23213.15%a-40.23713.48%算术平均：13.21%0.230.23113.08%0.23113.08%b-40.29617.36%算术平均：17.21%0.160.29117.03%0.29417.23%c-40.38323.08%算术平均：23.32%0.210.38923.47%0.38823.41%从表3.2可以看出，采用考马斯亮蓝G-250比色法测量奶粉中蛋白质含量相对标准偏差较小，符合分析要求。根据奶粉样品包装上的数据，b样品蛋白质含量18%，c样品蛋白质含量24%，可得到如下数据：表3.3：奶粉样品中蛋白质含量测定的回收率相对标准偏差样品编号吸光度（Abs）蛋白质含量回收率相对标准偏差（RSD%）b-40.29617.36%96.44%算术平均：95.87%1.090.29117.03%94.61%0.29417.23%96.57%c-40.38323.08%96.16%算术平均：97.16%0.880.38923.47%97.79%0.38823.41%97.54%从表3.3的数据可以看出，采用考马斯亮蓝G-250比色法测量奶粉中蛋白质含量的回收率相对标准偏差较小，说明测定的精密度比较高，符合分析要求13。3.1.3 小结从3.1.1和3.1.2中的数据可以看出，采用考马斯亮蓝G-250比色法测量样品奶粉中的蛋白质含量，回收率较高，分别达到了95.87%和97.16%，而且相对平均偏差（RSD%）均小于1.1，精密度较高。3.2 用凯氏定氮法测定样品中的总氮3.2.1奶粉样品中总氮的测定按照2.3.3 中所示的流程对奶粉样品进行凯氏定氮，每个样品做两次平行测定。计算出每100g样品中的总氮量，记录于表3.4.表3.4：a奶粉样品中总氮含量样品编号三聚氰胺添加（mg/kg）总氮量（g/100g）相对标准偏差（RSD%）a-11002.161算术平均：2.1580.502.154a-210002.215算术平均：2.2110.572.207a-325002.310算术平均：2.3181.062.325a-402.147算术平均：2.1510.492.154试剂空白样000表3.5：b奶粉样品中总氮含量样品编号三聚氰胺添加（mg/kg）总氮量（g/100g）相对标准偏差（RSD%）b-11002.786算术平均：2.7880.212.789b-210002.847算术平均：2.8420.782.836b-325002.933算术平均：2.9400.922.946b-402.782算术平均：2.7810.212.779表3.6：c奶粉样品中总氮含量样品编号三聚氰胺添加（mg/kg）总氮量（g/100g）相对标准偏差（RSD%）c-11003.720算术平均：3.7230.423.726c-210003.772算术平均：3.7780.853.784c-325003.882算术平均：3.8741.203.865c-403.719算术平均：3.7150.643.7103.2.2小结从表3.4、表3.5和表3.6可以看出，采用凯氏定氮法得出的奶粉样品中总氮，测量的相对标准偏差（RSD%）均较小，其