成骨细胞培养.doc

.成骨诱导液：地塞米松，-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：-MEM+10%FBS+50ug/mlascorbic acid+10mM -glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L 型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，13的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 茜素红染液 操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。2. 吸走中性甲醛溶液，用1PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3. 吸走茜素红染液，用1PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。用4周龄大鼠，用全骨髓贴壁法取得原代细胞，消化传代，用第3代培养至80-90%融合后，胰酶消化，接种在事先明胶包被的六孔板中，当细胞生长达接近80-90%时，使用cyagen的成骨诱导培养液诱导，每2-3天换液，诱导28天后，吸去六孔板中培养基，用PBS冲洗，加入4%中性甲醛固定30min，再次用PBS冲洗，加入茜素红染4min，PBS冲洗后观察。骨科手术中获得成人松质骨，经PBS 或者D-Hanks 液冲洗数次后剪成1 3 mm3 左右小粒，在1%庆大霉素中浸泡30 min。如不能立即使用，可浸泡于含12% 胎牛血清及青霉素、链霉素的Hams F12 培养液中，放在4冰箱过夜。 用PBS 或者D-Hanks 反复冲洗至小骨粒发白，移入小瓶中，加0. 25% 胰蛋白酶，37孵箱中消化20 min，弃去上清。 剩余小粒移入培养瓶，加入Hams F12 培养液，将培养瓶竖放或瓶底向上，并使小粒均匀分布; 将培养瓶放入5% CO2、37孵箱中培养2 h 后轻轻将瓶底翻转向下，继续培养5 7 d，观察细胞生长情况，酌情换液。( 为避免组织块脱落要轻拿轻放) 细胞