胎儿心肌钙蛋白T（cTnT）基因的克隆和序列分析.doc

论文专家件件精品热点关注：2010年黑龙江省公务员招录考试行政职业能力测验试卷高校本科毕业论文质量低下的原因分析与对策研究2008北大核心中国商贸征稿启事股票选择的模糊综合评判模型青春岁月杂志约稿函商情（经济理论研究）中国明星籍贯大揭秘议论文写作指导胎儿心肌钙蛋白T（cTnT）基因的克隆和序列分析李充璧， 杨利敏，谭芳，刘小强 王利春，阿丽娅， (肇庆学院生物医药工程中心, 肇庆市，526061 )摘要：人心肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）可调节肌丝蛋白的Ca2+浓度，从而调节心脏肌肉收缩的肌钙蛋白复合体组成成分之一。在心力衰竭末期，cTnT再度表达。cTnT的mRNA水平和其蛋白水平升高与心力衰竭密切相关。本文从正常流产胎儿心脏提取RNA，通过反转录获得cDNA，再利用PCR方法得到目的基因。序列分析证实，是正确而特异的cTnT基因, 不同人种的cTnT序列同源性很高，达99%以上。全序列有3个碱基与国外报道序列有差别，所编码氨基酸有2个不同。推测其区别可能是人种的差异或胎儿与成人发育期不同造成的。关键词：胎儿心肌钙蛋白T基因（cTnT）， 克隆，序列分析中图分类号 Q81，文献标识码 A人的心肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）基因位于染色体lq32上，含有17个外显子，通过替代剪切产生。有同型多态性的4种异构体存在1。在不同发育阶段表达不同的cTnT异构体。研究表明，在心力衰竭末期，cTnT高度表达。cTnT的mRNA水平和其蛋白水平升高与心力衰竭密切相关1。且cTnT基因存在个体差异，表现为基因的多态性2。因此，研究分析我国黄种人胎儿心肌钙蛋白特异基因的结构和功能，对探讨不同发育时期的心肌钙蛋白T基因的结构和功能以及心脏病的发病机制的分子生物学相关研究具有重要意义。本文从我国黄种人胎儿心脏肌肉中提取分离cTnT基因，并对其序列进行分析，为阐明cTnT基因在发育不同时期的结构和功能关系以及下一步对该基因功能的研究奠定基础。1.材料和方法：1. 1 材料汉族流产胎儿（取自内蒙古医学院第一附属医院妇产科），E.coli宿主菌DH5和BL21(DE3)plysS均为本室保存；动物组织小量RNA提取试剂盒购自上海华舜公司；superScriptTM First-Strand Sythesis System for RT-PCR 购自invitrogen公司；pGEM-T载体试剂盒、T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶为NEB公司产品；Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、X-gal、IPTG和琼脂糖购自上海生工；DNA分子量标志物购自大连Takara公司；1.2 方法1.2.1提取RNA取汉族正常流产胎儿，摘取心脏，液氮处理，用匀浆器将组织破碎，用RNA提取试剂盒提取总RNA。操作按照说明书进行。电泳及用紫外分光仪检测A260,A280，检测总RNA的提取质量。1.2.2胎儿心肌RNA的反转录取提取的总RNA（200ng/ul），用invitrogen公司的反转录酶进行反转录3，操作按照说明书进行。具体步骤如下：按照以下顺序加入试剂：总RNA 8l10mM dNTP mix 1l2M GSP(gene-specific primer) 1lDEPC-treated water to 10l65o5分钟，然后放冰上至少一分钟。按照以下顺序加入试剂：10x RT buffer 2l25 mM MgCI2 4l0.1 M DTT 2lRNase inhibitor 1ul把以上9l混合物加入RNA/引物 混合物，轻轻混匀，短暂离心。42o保温2分钟。每管加1l反转录酶，混匀，4250分钟。7015分钟，终止反应，放冰上。短暂离心，每管加1l RNase H，3720分钟，取2l做PCR。1.2.3 聚合酶链式反应根据报道序列我们分别设计了两条引物3，上游: P1(GCT CGA GAA AAG AAT GTC TGA CAT AGA AGA GGT G) 长度:34 Tm:72 GC%44.1 G-59.1 下游:GTCTAGATCTTTGGTGAAGGAGG 长度:23 Tm:56.8 GC%47.8 G-39.9上游，横线为XhoI和XbaI酶切位点。用宝生物公司的exTaq进行PCR，条件如下：94o3，94o30 52o 30 72o 120，4个循环，94o30 55o 30 72o 120，20个循环，72o 7，电泳检测，发现900bp的特异条带，胶回收3。1.2.4连接，转化取2lPCR回收产物连入PROMEGA公司的pGEM-Teasy载体，操作按照说明书进行。用CaCI2法制作DH5的感受态细胞，转化，涂板，过夜培养，挑取8个单菌落粗提质粒电泳检测，选取大小合适的菌落进行PCR检测(94o3，94o30 55o 30 72o 120，30个循环，72o 7)，PCR为阳性的菌落精提质粒酶切鉴定4。1.2.5序列分析将酶切切出目的片段的阳性克隆纯化后，送上海博亚公司测序，测得序列与GeneBank报道序列(ACCESSION NM_001001432)比较，分析其差异。2. 结果2.1总RNA提取质量的鉴定琼脂糖电泳，EB染色，照片如下，可清晰看到提取的RNA条带，A260/A2801.8，符合RNA提取的质量要求。图1：胎儿心脏中提取的总RNA电泳照片Fig 1. Electrophoresis of total RNA from foetus cardiac muscle.2.2 聚合酶链式反应PCR扩增出特异条带，琼脂糖电泳，EB染色，照片如下，可清晰看到目的带（900bp）,(图2)。图2：M为DNA分子量Maker；S经反转录后PCR扩增的目的基因样品。Fig 2. PCR product from foetus cardiac troponin T geneM: marker( DNA/EcoRI+HindIII); S: PCR product2.3 克隆载体的构建对阳性T载体克隆进行PCR检测和酶切检测（XhoI和XbaI双酶切）。琼脂糖电泳，EB染色，照片如下，可清晰看到目的带（900bp）和酶切下的质粒带。2.4 目的基因的酶切分析 用碱法提取重组载体质粒，然后用限制性内切酶XbaI和XhoI进行双酶切和单酶双酶切可切出2.98K的T载体和0.9k的肌钙蛋白T基因，单酶切可切出3.9k的片段。图3：M为DNA分子量Marker；1：重组载体经XhoI和XbaI双酶切；2：SalI单酶切。Fig. Enzymatic cleavage of recombinant plasmids 1: Recombinant plasmid digested with XhoI; 2:Recombinant plasmid digested with SalI; M: Mrker.2.4 序列分析测得序列与GeneBank (ACCESSION NM_001001432)报道序列比较可知，DNA序列中ATG上游-24含有转录因子结合位点CTAT是cTnT特异性基因启动子的特征，并有3个碱基的差别。即ATG下游147位的核苷酸密码子由AGA变成GAA。编码的氨基酸序列由报道的精氨酸（R）变成谷氨酸（E）。另外，在ATG下游367位的核苷酸由报道的序列A变成T，表现在编码的氨基酸上由异亮氨酸（I）变成苯丙氨酸（F）。测的序列比较结果见后页。cTnT PCR 照片图4. 克隆的cTnT基因的PCR鉴定 M: 分子量Marker；S：PCR产物 Fig.4 Identification of CTnT by PCR M：Marker； S：PCR sampleCTnT 测序 1. ACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCG 61从序列的比较可以看到110 ，111 ，329位的碱基发生改变，其他没有改变。经分析DNA序列同源性高达99%以上。cTnT编码的氨基酸序列比较：报道序列MSDIEEVVEEYEEEEQEEAAVEEQEEAAEEDAEAEAETEETRAEEDEEEEEAKEAEDGPMEESKPKPR 68克隆序列MSDIEEVVEEYEEEEQEEAAVEEQEEAAEEDARAEAETEETRAEEDEEEEEAKEAEDGPMEESKPKPR 68报道序列SFMPNLVPPKIPDGERVDFDDIHRKRMEKDLNELQALIEAHFENRKKEEEELVSLKDRIERRRAERAEQ 137克隆序列SFMPNLVPPKIPDGERVDFDDIHRKRMEKDLNELQALFEAHFENRKKEEEELVSLKDRIERRRAERAEQ 137报道序列QRIRNEREKERQNRLAEERARREEEENRRKAEDEARKKKALSNMMHFGGYIQKQAQTERKSGKRQTE 204克隆序列QRIRNEREKERQNRLAEERARREEEENRRKAEDEARKKKALSNMMHFGGYIQKQAQTERKSGKRQTE 204报道序列REKKKKILAERRKVLAIDHLNEDQLREKAKELWQSIYNLEAEKFDLQEKFKQQKYEINVLRNRINDNQK 273克隆序列REKKKKILAERRKVLAIDHLNEDQLREKAKELWQSIYNLEAEKFDLQEKFKQQKYEINVLRNRINDNQK 273报道序列VSKTRGKAKVTGRWK 288克隆序列VSKTRGKAKVTGRWK 288氨基酸序列分析可知，cTnT蛋白的氨基酸一级结构基本相似，同源性达98%以上，全蛋白序列中只有两个氨基酸不同，表明 cTnT蛋白在不同的人种中比较保守。3.分析与讨论肌动蛋白ATP酶活性需要Ca2+离子的参与，而肌钙蛋白（Troponin）具有连接Ca2+离子的能力，研究认为与疾病相关的cTnT异构体的表达改变，在人心脏中会改变肌丝的功能5。从实验结果可知，我们从我国黄种人胎儿心肌中分离到了肌钙蛋白T（cTnT）基因，从序列分析结果看，与西方人种的cTnT DNA序列结构的同源性很高，达99%以上, 且DNA序列中ATG上游-24含有转录因子结合位点CTAT是cTnT特异性基因启动子的特征6。分析实验结果，来源于PCR引物设计严谨。 cTnT蛋白在不同的人种中比较保守，提示cTnTDNA一级结构的相似性可预示不同人种的心脏病发病机制基本一致。我们所测定的序列分析发现，与国外报道的cTnT序列比较，共有3个碱基的差异，其编码氨基酸有2个不同，由于我们PCR采用了保真酶，所以推测序列的差别可能是由于东西方人种的差别造成的。蛋白序列中两个氨基酸的不同，是否是可变区或显示基因的多态性3，还有待进一步研究其基因的功能。根据其功能推测，2个氨基酸的差异，不会影响cTnT的功能但有人曾推测，人心脏功能的改变可能主要取决于该基因5区域的变化，在cTnT异构体序列的5端存在30和15nt的可变区3,6。由于我们所测定的序列不包括ATG上游的内含子序列，所以不能分析到其5端的启动子序列特征。 不过进行胎儿cTnT DNA序列的克隆和分析将对人的不同发育阶段心脏舒张和收缩功能、心肌代偿、心肌顿抑、缺血、心肌.病等分子机制的进一步研究奠定理论基础。参考文献1 Anderson P A.,Greig A., Mark T M et al.,.Molecular basis of human cardic troponin T isoforms expressed in the developing ,adult, and failing heart.J J Circ Res., 1995,76:681-6862 Townsend P J, Barton P I, Yacoub M H et al., Molecular cloning of human cardiac troponin T isoforms: expression in developing and failing heart. 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