实验九、DNA的重组与鉴定

实验九DNA的重组与鉴定 一 实验目的 通过本实验学会重组DNA的原理与方法 基因重组 不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子 二 实验原理 外源DNA片段和线状质粒载体的连接 也就是在双链DNA5 磷酸和相邻的3 羟基之间形成的新的共价键 如质粒载体的两条链都带有5 磷酸 可生成4个新的磷酸二酯键 但如果质粒DNA已经去磷酸化 则只能行成2个新的磷酸二脂键 在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口 当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复 实验原理 相邻的5 磷酸和3 羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化 这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶 重组DNA技术基本原理 切 接 转 筛 限制性内切酶酶切 切 酶切 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 T4 DNA连接酶 T4 噬菌体连接温度 不高于粘性末端熔点温度 Tm 15 15 6h 12 8h 8 12h 连接方式 相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGGCCGG GGCCGGCC CGGC CGGC CGGC CGGC CCGG GGCC Hap T4 DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA Alu DNA连接酶 AGCTAGCT TCGATCGA 重组体的转化 受体细胞 转 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 原核细胞的转化 细菌转化 1 受体细胞的选择 限制缺陷型 避免修饰和降解重组缺陷型 避免重组整合转化亲和型 较高的可转化性遗传互补型 利于筛选感染缺陷型 防止感染 2 转化方法 CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50 100mmol L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 重组体克隆的筛选与鉴定 筛 宿主细胞 转化后的克隆群体 1 遗传检测法 1 抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 2 标志补救 半乳糖苷酶法 LacZ基因N端序列 插入片段 LacZ基因失活 LacZ基因N端序列 LacZ酶 2电泳检测法 凝胶电泳检测 加样孔 DNAMarker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 原位杂交 3菌落杂交筛选法 三 实验仪器 超净工作台 台式高速冷冻离心机 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 恒温水浴锅 四 材料及试剂 E coliDH5 pUC19orT载体 DNA 四 材料及试剂 1 T4DNA连接酶2 10 T4DNA连接酶缓冲液 400mmol LTris ClpH7 5100mmol LMgCl2100mmol LDTT 500 g mlBSA5 10mmol LATP 试剂 灭菌去离子水 Kac 3mol L pH5 2 Xgal 20mg ml IPTG 200mg ml 五 实验步骤 1 混合以下溶液于一个无菌离心管中x lpUC19质粒 0 1 4 g 2 l10 酶切缓冲液1 5U限制性内切酶 EcoRI y l去离子水终体积为20 l2 在推荐温度下育温1小时 一般为37 加入5 l电泳缓冲液终止反应 电泳检测结果 酶切 实验步骤 1 混合以下试剂PCRDNA6 lpUC19酶切回收DNA1 0 l5 T4DNA连接酶缓冲液2 0 lT4DNA连接酶 10u l 1 l10 l混合液于16