【毕业学位论文】（Word原稿）大豆猝死综合症病菌检测技术研究及风险分析植物病理硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆猝死综合症病菌 检测技术研究及风险分析 摘要 大豆猝死综合症（简称 美国等几个大豆主产国的一种较新的、危害性很大的大豆真菌病害，它分别由两种镰刀菌 菌可在土壤中存活多年，可随大豆的贸易传入新的地区。中国是 美国等 防止大豆猝死综合症病菌随进口大豆传入中国，保护我国的大豆生产，本研究确立了检疫鉴定大豆猝死综合症病菌的检测技术，还确定了该病菌随进口大豆传入中国的风险水平。 本研究配制了从土壤中筛选、分离 可对 时抑制其他杂菌的生长；确立了 确了大部分中国大豆品种对 鉴其他学者设计的两对 行 果否定了这两对引物的特异性；利用 与 果显示，在 . F. . 此确立了，通过选择性培养基分离进口大豆中的土壤，进而以 通过风险分析，认为 菌是大豆生产上的毁灭性病害，经济影响大，符合检疫性有害生物的地理和管理标准及经济影响标准，是我国应关注的检疫性有害生物。病菌在中国定殖的可能性大，定殖后扩散的可能性大，随进口大豆进入中国并传播到寄主植物上的可能性大，因此， 随美国等疫区输华大豆传入中国的风险为高。根据风险评估结果，提出了降低风险的三个管理方案，实施任何一个方案都可降低 的传入风险。 关键词： 大豆猝死综合症，检测，有害生物风险分析 is a DS is a in to be to a a of of is to DS to DS to be by in to DS to be to In a DS A of is DS of DS DS by CR of DS NA of DS of . F. . DS be DS by of DS is a in be as DS is to of of to on of of DS to of 目 录 第一章 引言 . 1 豆猝死综合症的发生情况 . 1 豆猝死综合症的 分布与危害 . 1 豆猝死综合症的危害 . 2 豆猝死综合症的研究现状 . 4 原生物学 . 4 害的发生与发展 . 5 国有害生物风险分析情况和对进口大豆的检疫状况 . 7 国的有害生物风险分析情况 . 7 国对进口大豆的检疫状况 . 8 究的目的和意义 . 9 究的目的 . 9 究的意义 . 10 第二章 检疫研究 . 11 料和方法 . 11 试菌株 . 11 壤样本的采集 . 11 壤分离方法 . 12 养基 . 12 种方法 . 12 备 . 13 引物 . 14 物 . 14 试菌种 . 14 应 . 14 交 . 15 果与分析 . 16 壤分离结果 . 16 种结果 . 18 果 . 21 交结果 . 22 论与讨论 . 24 物学特征判定 菌 . 24 择性培养基 检测效果 . 24 养基的鉴定效果 . 25 种方法的鉴定效果 . 25 子生物学鉴定 菌 . 26 定效果 . 26 交鉴定效果 . 26 第三章 风险分析 . 28 言 . 28 险评估 . 29 理和管理标准 . 29 殖可能性 . 30 散可能性 . 32 济影响评估 . 32 豆猝死综合症病菌随大豆进入中国的可能性 . 33 豆猝死综合症病菌随进口大豆传入中国的风险评估小结 . 34 险管理 . 35 险管理备选方案 . 35 险管理方案效率和影响评估 . 36 险管理总结 . 36 险分析结论和影响 . 37 第四章 研究展望 . 38 参考文献 . 39 致谢 . 45 作者简历 . 46 1 第一章 引言 大豆（ 源于中国，属豆科，蝶形花亚科，大豆属，迄今在我国已有五千多年的种植历史。它既是重要的油料作物，也是植物蛋白质的主要来源，可作粮食和副食，又是主要的牲畜饲料和工业原料。中国大豆品种资源丰富，类型多，适应性强，而且品质好，在我国国民经济中占有十分重要地位。 世界上为害大豆的病虫害有上百种，目前，已列入我国检疫性有害生物的、可为害大豆的有害生物有大豆疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒等。近年来国外大豆病虫害的发生情况有了一些变化，一些新 的重要有害生物引起了各国学者的广泛关注，其中较为突出的就有大豆猝死综合症，也称大豆突死综合症（ 吴品珊等 2003）。 大豆猝死综合症，英文名称为 简称 近二十年来在美国等国大豆上发生的一种由镰刀菌引起的较新的真菌病害。该病于 1971 美国阿肯色州首次发现，到 1982 年此病害导致该州大豆产量严重下降后，引起了人们的重视，根据其发病迅速的特点，定名为大豆猝死综合症（ et 1997）。 大豆猝死综合 症病菌在 1982 年被定名为 1997 年确定为 f. 2003 年病菌被分为 美 美 et 2003）。 大豆猝死综合症危害性很大，在适宜的条件下可引致 100%的损失。 2004 年 美国最大的两个大豆种植州伊利诺伊州和依阿华州，因生长季节长期的低温多雨天气，导致了十年来最严重的 情，直接经济损失高达数亿美 元， 经济影响很大。 我国是大豆生产大国，产量居美国、巴西和阿根廷之后，列世界第 4 位。但我国的大豆生产还远远满足不了国内市场的需要，每年都要从国外进口大量的大豆。据海关统计，从 2000 年至 2002 年，我国从美国、巴西和阿根廷进口大豆的总量为 3551 万 t，这些主要的出口国都是大豆猝死综合症的疫区。 大量国外大豆进入中国，势必会增加大豆猝死综合症等危险性有害生物入侵中国的风险，防止大豆猝死综合症病菌随进口大豆传入中国，是我国检疫部门亟待解决的问题。为此，国家质检总局设立了“大豆上几种重要的检疫性有害生物检疫方法研 究”的课题，同时在我国即将公布的、重新修订的进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录中，也将 菌列入。 以下就大豆猝死综合症的发生情况、研究现状和我国对进口大豆的检疫状况等进行简要的概述。 豆猝死综合症的发生情况 豆猝死综合症的 分布与危害 大豆猝死综合症主要分布在美国、巴西、阿根廷这 三 个大豆主产国 ， 加拿大曾在 1998 2 年报道了加拿大大豆上首次发生 et 1998），但此后很少有报道。 中国尚未有发生此病的报道。 自 1971年 迅速扩展到密西西比、密苏里、肯塔基、田纳西、伊利诺斯、依阿华、印第安纳等州，到 1986年， 3个州发生（ et ，美国的病原菌为 et 2003）。 阿根廷于 1991年和 1992年首次报道了在彭巴司草原的大豆上发生 大豆猝死综合症。 1992年和 1993年该国的西北部的大豆产区也发现了 根廷的病原菌既有 有 et 2003）。 992年，但早在 1981年巴西的大豆田间就有 00多万公顷大豆的产区，巴西中南部的 99个县都有此病害 。巴西的病原菌是 et 2002），同时它还将有自己独特的种 即将 定名为 人通信）。 豆猝死综合症的危害 自 1971年发现 大豆猝死综合症后 ，一直没有确定病名。直到 1982年，由 于田间发病严重，M. 其命名为 大豆猝死综合症。此名称对病害的特征概括并不准确，因为病害的进展与品种的抗性、环境条件和植株的生育期都有很大的关系，只有在适合发病的环境条件下，敏感品种的未成熟植株会快速死亡。但不论如何，发病的叶部组织总会很快的枯死掉（ et 1997） 。 大豆猝死综合症可表现在幼苗期、花期和荚果充实期，叶部和根部都有症状，环境条件适合时，症状一旦出现，整个植株就停止发育，迅速死亡。 片上有 圆形 褪绿色 斑点，斑点沿叶脉扩大，叶边缘干枯，变褐，有时卷曲。根部褐色，侧根稀少，见图 面上首先出现圆形至不规则型的几个毫米或更大的 褪绿色斑点，斑点扩大坏死或愈合成叶脉间枯黄的伸长区，最终部分或全部的枯黄组织坏死，仅在靠近主脉处保留一点绿色组织，叶片的边缘通常会伴随有卷曲的现象，有时成杯状。发病重时叶片脱落，仅留有叶柄悬挂在茎上。在花期和荚形成期间，除叶部症状外，花和果荚往往败育和发育不全，发病 轻的植株虽能结荚，但豆粒小，没有生活力。 高温干燥天气下，症状可以减轻，见图 根部症状与叶面症状密切相关。叶面不表现症状或症状轻微的植株，根部无症状；叶片发病严重时，则根部腐烂，因为侧根腐烂，整个植株容易从土壤中连根拔起。纵向剖开根茎部，维管束从灰到红色的褐变可从主根扩展到地面以上几个节的茎部，但髓部仍保持白色。发病严重的植株主根和下部茎杆上可形成肉眼可见的蓝色菌落，即是 可作为田间鉴定 et 在田间，植株高度与发病的严重程度无明显的相关性，但在温室人工接种试验中，会导致植株矮小。大田发病，最初 以圆形或椭圆形点状区域发生，气候条件适宜时，则迅速蔓延成片，远望去呈火烧状 。 3 图 豆幼苗 DS of 图 DS in 大豆猝死综合症在疫区的发生趋于普遍和严重。 据统计，在美国南方大豆产区，19881994年，每年因此病损失大豆 28万 t，在北方大豆区， 19891991年，每年因此病损失大豆约 17万 t。 1994年 t，阿根廷损失 t，有些田块产量损失达 90% ( et 这些数据表明， 4 豆猝死综合症的研究现状 原生物学 发现 者们根据其在 病原定名为 后来又称为 型，由于它的孢子形 态和菌落特征与引起菜豆根腐病的菜豆茄镰孢 度还被认为是 经过很多研究者的多次田间和温室实验 ， 直到 1997年将其确定为 大豆茄镰孢菌（ 997， et 1997， et 1995） 。 近年 究者认为 据 至少包括 26个种。由此， 003年根据 引起 大豆猝死综合症 的病原菌分为两个种 逗号镰孢菌 T. 孢菌 . O F. 主要分布在北美， 又称北美 大豆猝死综合症病菌 ； F. 要分布在阿根廷，也称南美 大豆猝死综合症病菌。 f. T. O菜豆镰孢菌。在巴西发生的 时还有一个他自己独特的种，今后可能命名为 人通信）。 、 这些培养基上都能产孢，所产生的大分生孢子形态很一致。显微镜下，分生孢子呈现赤蓝至深蓝色。菌落表面的色素变异很大，主要取决于产孢数量。在分离的、散生的产孢器里产生蓝色至蓝绿色的粘液堆。孢子堆在培养基中心向四周扩散，连续性生长，产孢丰富的分离株，除边缘一些灰白色不产孢的菌丝外，孢子堆可长满整个培养皿。在老化的培养基中心 常常 可以看到较小的、分散的、奶油色的分生孢子堆。随着菌落的年龄增长，其颜色也由蓝绿色 变化成蓝紫色。菌落的颜色是形态学鉴定 et 1997） 。 此菌很少产生小分生孢子，在单一或分支的孢子梗上产生大型分生孢子。大分生孢子通常有三分隔和四分隔，偶尔可见五分隔或更多分隔的孢子。 在 F. F. . 显微镜下，它们的分生孢子有细微的差别。 F. 窄又长，明显的比 F. . ，尤其是三分隔孢子，长度可达 60m； F. 可产生逗号形分生孢子；而 F. 形态与 F. F. 两端逐渐变细，弯曲，形成对称结构，而 F. 在 基上 F. F. . 4581 4 27563258 m（ et 2003），见图 片来源于 2003。） 5 F. F. . 垣孢子肉眼就可以观察到，它们 单一或者成对形成 ， 要么在菌丝末端 ， 要么在菌丝的胞间。 害的发生与发展 （ 1） 大豆猝死综合症病 菌的致病机制 在土壤和根部残屑中越冬的厚垣孢子是病害的初侵染源。厚垣孢子萌发后能定殖和侵染植株的根，初侵染时，定殖仅局限于根部和下部茎杆皮层组织，菌丝在细胞内和细胞间隙生长，主要是在细胞内。到植株的生长后期，皮层可看到菌丝，在此阶段，厚垣孢子在降解了的开始脱皮的皮层组织里形成。在靠近土壤的根部，可以看见蓝色或蓝绿色的大分生孢子堆，在根部形成的分生孢子通常与根腐有关。 田间和温室接种试验证明， 究发现，染病植株上有症状表现的叶片提取液中含有一种毒素多肽 这种多肽接种到健康植株，可以导致子叶和叶片变黄、卷曲直至干枯。而染病植株上未 表现叶面症状的叶片提取液中没有发现这种毒素多肽。 田间和温室观察发现，叶面显症和病原物在根部侵入和定殖是同时的，说明叶面显症和根部发病的致病机制不同，叶面症状可能是 根部病原菌激发的毒素引起的，其中的致病机理还有待深入研究（ et 1995）。 （ 2） 致病性的影响因素 温度、土壤湿度和土壤中的大豆胞囊线 虫 5，如果在开花和结荚期或之前遭遇低温天气，病情迅图 . f F. . . . . 6 速发展，严重影响当年的大豆产量。低温对叶面和 根部症状的影响是不同的，叶片在 2224发病最重，根部在 15发病最严重 （ et 1995） 。 土壤湿度与产孢速度呈正相关，湿度越大，产孢速度越快，数量越大。这些分生孢子随雨水或灌溉冲到土壤中，使病情由点扩大成片。 近排水沟的植株发病比中间田块的植株发病严重，温室中灌溉了的植株叶片先发病。但是营养生长期间，湿度大对病害流行的 影响，各研究者的意见尚未统一（ et 1995）。 早在 20世纪 80年代初期， 次提出大豆胞 囊线虫和低温高湿是 在 4个州的 30个 70% 80%表现这并不说明 大豆胞囊线虫 是病菌 侵染大豆的必要条件，它只是帮助病原菌侵入大豆根部的皮层组织，加速病情的发展。 大豆胞囊线虫 的定殖会严重影响寄主的生活力和抗病性， 其影响主要表现在争夺植株的营养 ， 破坏根系对营养和水分的吸收，阻滞根系的发育，降低大豆固氮根瘤菌的数量 。 二龄幼虫 的 根系侵入和成熟雌虫的膨大 ，会撑破根表皮，增加根表的开放度，为其他土居病原物提供侵染点，使大豆植株对 如 立枯病、灰斑病、茎溃疡病 等 的敏感性增加 ，产生协同侵染效应（ 1983）。 1986年 ， 将厚垣孢子从胞囊中分离出，证实其能在胞囊里安全越冬并保持侵染能力。实验证明，胞囊能增加 越冬能力与病原菌的侵染力与扩散能力是密切相关的。一般来说，寄生在胞囊里的单个病原菌可以避免与土壤中的其他微生物争夺营养和空间，比其他的生活在土壤或大豆残体上的厚垣孢子有更强的越冬能力，而且胞囊还为厚垣孢子的萌发和病菌最初的生长提供了基本的营养（ et 1997）。 另外，发病范围的扩展与大豆胞囊线虫的移动有关。当然 , 胞囊线虫自身蠕动距离有限，主要通过农事耕作、田间水流或借风携带传播，也可混入未腐熟堆肥或种子携带远距离传播 。 （ 3）病菌的分离与鉴定 国外有关 究初期，形态学鉴定占主导地位，上个世纪 90年代末，分子生物学技术迅速发展，分子鉴定逐渐地显示其独特的优势，弥补了传统的形态学和培养性状鉴定的不足。 在发病的叶片上很难分离到病菌 ， 目前普遍采用的方法 是从土壤或根部分离病原菌。先在 s 择性培养基上进行稀释培养，再将目标菌株转移至营养培养基上培养，如 et 2001）。 菌落呈蓝色，生长缓慢，镰刀型、有隔的大分生孢子，少或无小分生孢子等。但这些培养特征往往是不可靠的，因为其他的某些 F. 合种 也会在培养基上产生相似的性状。因此分子生物学技术为病菌的鉴定提供了快速可 靠的手段，弥补了形态学方法的不足。 2000年， 4个来自不同地区、不同寄主的 F. F. . 为所有的 F. 在 F. 与 F. 统树分析证明， F. et 2001）。利用 14种从大豆上 7 分离的 F. 4种从其他寄主上分离的 F. 合种 进行 发现所有的 F. 度为 626其他的 F. 们随后根据测序结果，设计了一对特异性引物 有 F. 38用巢式 10田间大豆根部和土壤中 F. et 2003）。 随着荧光 的高灵敏性和无污染的特征解决了 2004)第一次利用实时 荧光定量 根据 计一对特异性引物 ，为 分子鉴定开辟了一条新的道路。 （ 4） 病害防治方法 生产上对 制灌溉和轮作等方式。 选择抗病品种是一个有效的防治方法 ， 譬如 对大豆胞囊线虫有抗性的大豆品种通常对 通过防治大豆胞囊线虫从而降低 麦、羊茅属作物或者对大豆胞囊线虫有抗性的品种的轮作可降低田间里大豆胞囊线虫的数量，从而降低 et 1995） 。 该病在土壤湿 度大的条件下容易扩展 ， 控制田间水分 ， 适当降低土壤湿度 ， 也可起到减轻病害的作用 （ et 。 国有害生物风险分析情况和对进口大豆的检疫状况 国的有害生物风险分析情况 2001 年 12 月 11 日， 我 国正式成为 世界贸易组织（ 143 个 成员 ，我国除了可以享受 员经多年谈判所形成的规范国际贸易的多边协定带来的好处之外，还必须全面履行各种多边贸易协定，其中规范货物贸易中的植物检疫行为的是实施卫生与植物卫生措施协定（简称 确要求植物检疫措施应 建立在有害生物风险分析的基础之上。有害生物风险分析是 中文译文，简称 在联合国粮农组织 1999 年版的国际植物检疫措施标准第 5 号：植物检疫术语表的定义是：“评价生物学或其他科学、经济学证据，确定某种有害生物是否应予以管制以及管制所采取的植物卫生措施力度的过程”。 在 80 年代末期应用到植物检疫领域里的一个新术语，现在，包括我国在内的世界各 员国的植检机构都按照联合国粮农组织（ 国际标准和准则进行 实施任何 施时都基于风险分析，严 格遵守与 关的有害生物风险分析准则（ 检疫性有害生物风险分析准则（ 非