【毕业学位论文】（Word原稿）石系亚1号（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 石系亚 1 号 （ .） 全生育期均一化全长 库的构建 (.) in (.) in I 摘 要 石系亚 1 号是二倍体 亚洲棉，基因组 传性状稳定，抗枯萎病， 耐瘠薄 ，耐 旱抗寒 ， 不易脱 铃烂铃，相当于亚洲棉的标准系。为了充分发掘控制石系亚 1 号优良性状的基因，并对石系亚 1 号进行功能基因组学研究， 利用二倍体亚洲棉 石系亚 1 号 为材料，建立 了石系亚 1号 全生育期 的 均一化全长 为尽量包含石系亚 1 号不同时空表达的基因， 根据形态及发育状况对石系亚 1 号不同发育时期的各种组织器官进行 了 多次取样，确保了样品的完整性 。具体是： 子叶期 整株取样两次； 1期、蕾期、花铃期的叶片和花；现蕾 5、 10、 15、 20、 25 天的 蕾；现花3、 5、 10、 15、 20 天的铃；共 6 部分材料。 采用改良的 成功地提取了 上述 材料的总 为了避免 建库带来的干扰， 用 化出了 过 证了 完整性。 为了 尽可能多的得到 石系亚 1 号 全生育期表达的 各种 基因，将石系亚 1 号 不同 时空表达的 所有 基因尽可能的包 含 在文库中，同时能够把高表达的持家基因的丰度降 低。将来自 6 部分材料的合到一起， 利用 对 其 进行了均一化 。均一化之后，将双链 端削平，加上含有 切位点的衔接子（ 使用 切之后，回收大小在 500间的 断。将回收的片断连接到 L 包装蛋白对连接产物进行包装，即 构建了石系亚 1号全生育期的均一化全长 经过检测， 初级文库的滴度达到 2 106组率为 90，插入片断平均长 度大于 1初级文库的质量符合要求。对初级文库进行了扩增， 扩增文库的滴度达到了 5 109 文库的质量符合要求。 为了验证该库的质量， 利用植物抗病基因保守区设计了 6对 简并引物 ，用 条 抗病基因同源序列（ 。 对 简并引物 对 6 获得的序列测序， 得到了一条273 断。使用 比对， 发现 它 与 编码 拟南芥细胞膜上的载体蛋白的 很高的相似性，相似性达到了 82，该蛋白负责胞内物质运输。 蛋白翻译表明该 推测 其可能是跨膜蛋白， 具有信号传导的作用，极有可能与抗病有关。对其进行组织特异表达验证，证明它在各种组织器官中均有表达，且表达量基本相同，可以认为它是组成型表达的。 将测得的序列提交 到 录号： 均一化全长 库为石系亚 1 号的功能基因组研究提供了一个良好的工作平台， 为研究石系亚 1 号发育相关的基因提供了基础， 增加了发掘各种稀有基因的可能性 ，同时可以用于 为进一步测序以建立棉花的 将为棉花基因克隆和功能基因组研究奠定很好的基础平台。 关键词 ：全生育期，均一化全长 库， 花 s (2n=26) to to It is In to of , a in of in of in of in NA a NA to SN I L of 106 0%. of of of of 109 of to to In to of of CR GA it 2% to of . . to ST 录 第一章 引言 . 1 言 . 1 花基因组学研究 . 1 库的构建 . 6 一化 库的构建 . 6 一化全长 库 . 7 物抗病基因同源序列 究进展 . 11 题依据及意义 . 12 题依据及意义 . 12 验目的 . 13 验路线 . 14 第二章 石系亚 1 号全生育期均一化全长 库的构建 . 15 料与试剂 . 15 料 . 15 学试剂、酶及试剂盒 . 15 验方法 . 16 提取 . 16 分离纯化 . 17 合成 . 17 均一化 . 17 链 端补平 . 21 链末端加 接头 . 22 链 端的磷酸化 . 22 胶回收 . 22 噬菌体臂的连接 . 22 装 . 23 库滴度检测 . 23 库扩增 . 23 实验结果 . 24 提取 . 24 分离 . 27 转录成全长 . 28 一化 . 29 端削平加接头 . 31 大小回收 断 . 31 库滴度检测 . 32 入片断大小检测 . 33 增文库的滴度检测 . 33 论 . 34 样 . 34 花总 提取 . 34 纯化及反转录 . 34 一化全长 库 . 35 第三章 抗病基因同源序列的克隆 . 36 要试剂 . 36 验方法 . 36 并引物设计 . 36 库程序 . 36 回收 . 36 接到 体 . 37 物对 6 获得的片断的组织特异性表达检测 . 37 实验结果 . 37 并引物的设计 . 37 并引物筛库 . 37 凝胶回收 . 38 接 . 38 列结果 . 38 列分析 . 38 织特异表达验证 . 42 . 43 第四章 创新点 . 45 第五章 结论 . 46 号全生育期的不同组织的 . 46 建了石系亚 1号全生育期的均一化全长 . 46 简并引物筛库得到了 6条 . 46 兼并引物对 6获得的序列进行了组织特异性表达的验证 . 46 参考文献 . 47 附录 . 54 致谢 . 55 作者简历 . 56 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文全称 bp 基对 六烷基三乙基溴化铵 , 甲基甲酰胺 甲基亚砜 二胺四乙酸 丙基 鼠白血病病毒 家植物基因组计划 国的国家科学基金 OD 密度 合酶链反应 菌斑形成单位 乙烯吡咯 烷酮 病基因同源序列 分钟转速 NA 热水生菌 羟甲基氨基乙烷 43中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 言 花基因组 学 研究 因组学的诞生和发展 1920 年， 基因 （ 和染色体 （ 组合在一起，提出基因组 （ 词 （ et 1997） 。 1953 年， 现了 双螺旋结构，揭示了基因的分子本质，开创了生命科学的分子水平的新时代，生命科学得到了前所未有的快速发展。 1986 年， 出基因组学 （ 1997）。基因组学是对基因组进行作图 (包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱 )、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。 1990 年，人类基因组计划（ 动。 2003 年 4 月 14 日，美国人类基因组研究项目首席科学家 士在华盛顿隆重宣布 ： 人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划 (所有目标全部实现。这标志“人类基因组计划”胜利完成 和“后基因组时代” ( 式来临，在 “ 出 50 周年之际，生命科学 又 诞生了一个新的里程碑。 誉为可与“曼哈顿原子弹计划”“阿波罗登月计划”相媲美的伟大系统工程，是人类第一次系统、全面地解读和研究人类遗传物质 全球性合作计划。人类基因组序列图的成功绘制是科学史上最伟大的成就之一，奠定了人类认识自我的重要基石，推动了生命与医学科学的革命性进展。在后基因组时代，生命科学关注的范围越来越大，涉及的问题越来越复杂，采用的技术越来越高，取得的成就将越 来越多，生命科学及其相关科学将大有作为。 物基因组学的研究 1991 年，美、英、欧盟启动了拟南芥基因组计划。同年，日本启动了水稻基因组计划，并极力鼓励本国科学家申请基因组信息方面的专利，这充分说明了各国对基因资源的重视。 1997 年，美国启动了国家植物基因组计划（ 紧接着， 法国于 1999 年初启动了植物基因组研究计划。 要有三方面 的研究内容共：第一，结构基因组研究；第二，功能基因组研究；第三，将基因组的信息和知识应用于开发和改良植物和以植物为基础的研究。结构基因组研究旨在绘 出包括玉米、大豆、小麦、大麦、高粱、水稻、棉花、西红柿和松树等具有经济价值的重要植物的基因图谱。功能基因组的研究重点是对作物产量，品质，抗病和生长发育相关的基因的研究。 2000 年 12 月 模式 植物拟南芥（ 全基因组序列分析结果 公开发表 （ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 2000）。 2002 年，华大基因研究中心和美国 司完成了对 籼稻品种 93粳稻 “ 日本晴 ”的全序列草图 (Yu et 2002. et 2002)。 随着拟南芥 和水稻基因 组测序的完成，植物基因组研究也进入了功能基因组阶段。测序的完成只是基因组工作的开端，更重要的工作是对基因的功能的研究 ： 美国 2001 年开始启动“拟南芥功能基因组研究 2010 计划”，即用 10 年时间于 2010 年前破译拟南芥全部基因的功能。 功能基因组的研究是后基因组时代的核心，研究重点从单个基因转向整体系统化的研究，从某个基因某个性状发展到这个植株的系统发育调控， 以及 基因在时空表达差异。 目前植物功能基因组的研究主要包括：基因表达概况的研究；基因功能的 研究；蛋白质及其功能即蛋白质组的研究。 植物功能基因组研究 的方法主要 包括 异显示技术（ 制性消减杂交（ 代表性序列差别分析（ 基因芯片 ( 基因微阵列技术( 基因表达系统分析 (of 表达序列标签( 蛋白质组技术 (， 生物信息学 ( 转基因 (， 基因敲除 ( 扰技术等等。目前应用较多的是 因芯片，蛋白质组技术，反向、正向遗传学技术及生物信息学技术等。 前主要被用于寻找新基因和了解基因的表达概况，一般应用的程序 如下 ： 建立 目标材料 的 库 ； 从文库中随机挑取克隆进行测 序 获得 将所得的 据与 数据库的数据比较 分析，获得目标材料 的基因 进行系统分析，并发掘新 基因。大量的 据给基因芯片技术提供了丰富的资源，加快了基因芯片技术的 发展。 花基因组研究概况 棉花是世界上重要的纤维作物， 也是主要的经济作物 。 现在世界广泛栽培的棉种有四个，即亚洲棉 (.)、草棉 (.)、陆地棉 (.)和海岛棉 (.)。 其中，陆地棉 (.)和海岛棉 (.)是 4 倍体 （ 2n 52） ， 亚洲棉 (.)和 草棉 (.)是 2 倍体 （ 2n 26） 。 棉花的基因组相对较大，约 3000究 落后 于水稻、玉米等其他农作物 。棉花基因组的研究主要包括以下几个方面。 子标记的发掘 应用于棉花基因组研究的分子标记技术主要有 、 、 。分子标记方面做的研究也比较多，为遗传连锁图的绘制奠定了一定的基础。 （ 2004）报道了根据 制的二倍体 D 基因组以及四倍体 进行了相关的研究。 国内 ， 左开井等（ 2000）利用 建陆中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 地棉分子标记连锁图 ，林忠旭等（ 2003）利用 种分子 标记构建棉花分子遗传连锁图 。 和 的构建 学和加州大学 校共同承担了美国国家植物基因组计划中的棉花部分，其中 学负责 库资源，并构建了陆地棉的 （ et 2001），产生了 129， 024 个克隆，平均插入片断 140在的实验室建立了棉花的 （ 1993）。 国内 ， 郑拥民等（ 2004）构建了中棉所 12 的 库。 和 都是非常 重要的基因组文库，可用于物理图谱的绘制。除了 ， 也可应用于物理图谱的绘制。 棉花的很多重要的性状都是由 制，进行 位有很重要的意义。 棉花的析，除了运用 ，还运用 标记 ， 分析的主要性状主要是棉花的纤维品质（王坤波等 , 1999）。 高玉千等（ 2003）对陆地棉抗黄萎病基因进行了 位。沈新莲等（ 2001）对棉花高强纤维主效 遗传稳定性进行了研究。 花 功能基因组研究 因的分离与克隆 棉花基因的分离与克隆主要集中在：纤维发育相关基因的克隆，酶的基因的克隆和抗病相关基因的克隆。这三方面的国内外研究都比较多，研究对象多是陆地棉。基因克隆的方法也比较多。 1992 年， 首次从陆地棉 克隆到了 因以 来，已经克隆了很多棉花纤维基因。 (1996)构建了 陆地棉纤维（ 库，对棉花的 因进行了研究。 （ 2001）利用 术从棉花纤维细胞中获得了 10 个纤维发育相关的 i 等（ 2002）构建了陆地棉 维的 库，并从中得到全长 S （ 2002）利用 异显示技术、 术以及斑点杂交等技术发现棉花纤维伸长有关的 （ 1990）构建了陆地棉的库，分离了编码异柠檬酸裂合酶的 （ 1993）从陆地棉 等（ 1994, 1995）从陆地棉中分离得到核糖体蛋白 16和蛋白 . 1994）构建了陆地棉胚珠的 亚基的全长 R L （ 1996）从陆地棉中得到编码几丁质酶和 1,3葡聚糖酶的 在国内， 王学德等（ 2000）利用 法从陆地棉标准系 纤维细胞 克隆了一种纤维细胞优势表达的 M （ 2003）利用 据库结合 陆地棉分离得到跟棉花纤维发育有关的 因。 张天真等（ 2004）构建了陆地棉 (维的 列，并用 选方法从中克隆了 白的全长 列，进行了表达分析。 朱玉贤利用 离并且分析了 陆地