【毕业学位论文】（Word原稿）寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究昆虫免疫硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 on in of s on in of 要 利用自制微孢子虫（ 液（ 107个孢子 /毫升）与 50%的白糖水 1： 1混合，以每次 20毫升剂量对幼年健康意蜂 (行感染，每日一次，连续 21次，制作动态病理模型。从感染即日起 ,每日取血浆样品一份 ,共收集血淋巴样品 30 份。采用考马斯亮蓝法（ ，测定蜜蜂血浆蛋白总量；另分别随机抓取一定数量的患病蜜蜂及健康蜜蜂，利用血球计数法比较它们血淋巴中血细胞数量的差异。 结果显示：病蜂血浆蛋白总量，在感染后 1 10 天呈上升趋势，然后逐渐下降， 13 30 天保持在感染前蜜蜂血浆总蛋白水平以下；同时患病蜜蜂的血淋巴中血细胞平均数量大大高于正常蜜蜂。这说明蜜蜂对于微孢子虫的侵染有一定的免疫防御能力，同时，微孢子虫的长期寄生造成蜜蜂血浆蛋白明显下降。 自然感染大蜂螨（ 的青年意大利工蜂 (健康对照组，采用考马斯亮蓝法（ 法，测定其血淋巴蛋白质总量，并用高压等电点聚焦法进行血淋巴蛋白质分类。其结果表明，螨害组血淋巴蛋白质平均含量为 毫升，健康对照组为 毫升。螨害组与健康组血淋巴蛋白质含量差异极显著；高压等电点聚焦分析结果表明，自然感染大蜂螨后，成蜂血淋巴蛋白质组分与健康对照组相比较发生了明显的改变。 关键词：寄生虫，蜜蜂，血细胞，血淋巴蛋白 he s in 1 of 0 to 7th of of to 0 of as as of of of in of in of a by 录 第一章 绪论 1 一、昆虫物理防御屏障 1 二、昆虫免疫应答 3 三、本项研究目的及意义 8 第二章 实验部分 9 第一部分 患孢子虫病蜜蜂血细胞与正常蜜蜂差 异比较 9 试剂与材料 实验方法 第二部分 患孢子虫病蜜蜂血淋巴总蛋白动态变化模型 11 试剂与材料 实验方法 第三部分 螨害蜜蜂血淋巴蛋白含量与正常蜜蜂的比较 13 试剂与材料 实验方法 第四部分 螨害蜜蜂血淋巴蛋白组分与正常蜜蜂的比较 15 试剂与材料 实验方法 第三章 结果 18 第四章 讨论 21 参考文献 25 致谢 31 附录 32 作者简介 40 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 1 第一章 绪 论 对所有生物而言，当患病或受伤时维持其机体的平衡非常关键。在维持机体健康的生理机制中，神经、内分泌及免疫系统则起着至关重要的作用。动物借助于自身的免疫系统来抵御外源生物的侵入。虽然昆 虫没有脊椎动物那么复杂的免疫系统，但它们也发展出了另外一种防御机制能很好地保护自己不被侵害。其免疫系统也是多种子系统相互联合以共同抵御病原物的入侵。目前一般认为昆虫的防御体系主要由两部分构成，即物理防护屏障（例如表皮、中肠壁及气管壁）和有生理活性的杀菌物质如溶菌酶、苯酚氧化酶等参加的细胞免疫反应，例如吞噬 975及包被 968； 979； 970作用等。还有一些免疫蛋白及多肽在正常的血淋巴中不存在或含量极低 981； 1987，通过诱导可被大量合成而起到抑菌作用。 一、物理防护屏障 昆虫包裹中肠内容物的营养膜、中肠壁、表皮及气管壁组成了一道机械及物理屏障以保护其免受各种病原微生物、杀虫剂及其它各种物理及化学伤害的侵扰。所有昆虫的这种屏障均没有特异性。而蜜蜂则在此基础上更为进化，例如细胞表面缺少一些特征的病毒受体及有利于病原侵入的代谢产物。例如，蜜蜂对能侵染蚕的 及等 1998。昆虫 的抗性会随着其不同的发育阶段而变化。蜜蜂的幼虫对幼虫芽孢杆菌（ 蜂美洲幼虫腐臭病病原） 965； 942、蜂房蜜蜂球菌（ 蜂欧洲幼虫腐臭病病原）及、蜜蜂囊状病毒（ 1963； M 1976敏感，而成年蜂则只会被病毒 （ 袭患麻痹病。研究人员经过调查不同日龄幼蜂对气管壁虱（ 963的抗性不同，这说明新出房蜜蜂（小于 10 天）气管系统的物理防护屏障决定着蜜蜂对这种壁虱的敏感程度。 1、表皮 昆虫的表皮具有皮肤、骨骼及食物的储备的功能，并且对水、离子、化学物质、杀虫剂及病原物形成一道天然屏障 1975。表皮坚硬则会减少因磨损产生伤口而造成微生物侵入的机率。附着于蜜蜂表面的细菌、菌丝体及真菌孢子等会随着外表皮的蜕皮而被从身体上清除928。在表皮中还有一些具有杀菌活性的物质，包括有酶、蜡质及不饱和脂肪酸等988，它们充满了整个表皮内部及表面。但如果某种微生物可以合成几丁质酶（一中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 2 种专门攻击表皮几丁质的酶），则有可能穿透表皮，同时一旦表皮被穿透，其它一些微生物（尽管不能产生几丁质酶）也会由这一伤口进入昆虫体内。 973； 990 2、中肠 中肠是病毒、细菌、真菌及多数原生动物侵入昆虫身体的主要途径。微生物侵入中肠的能力取决于微生物自身的特性及造成能提高中肠渗透性的物理及化学磨损的因素。前肠与后肠的几丁质衬底作为一种物理屏障能有效防御微生物的侵入。除此以外，中肠中的系列生化环境 也能起到有效抵御外源微生物特别是细菌的侵入，这些生化条件包括有消化酶、 975。 在贮存的蜜蜂花粉等蜂粮中也有具有抗菌活性，主要是由于其中的酸性物质、渗透压及大量过氧化氢的产生与不断积累。由于蜂蜜的 一般介于 种酸性环境可对许多种细菌的生长与繁殖产生抑制 979。蜂蜜是一种具有高渗透压的介质，这种渗透压可杀死许多活细胞。由葡萄糖氧化酶产生的过氧化氢是成熟蜂蜜主要的抗菌物质，这种葡萄糖氧化酶来源于工蜂咽下腺的分泌。 3、围食膜 由于中肠的上皮细 胞没有几丁质外壳覆盖，因此极易被机械磨损并侵入微生物。然而蜜蜂同其它昆虫一样，其中肠的上皮细胞并不直接与食物接触，而是有一层黏稠的胶状物质将食物包裹起来，这种物质称为围食膜（ 这层围食膜可以起到保护中肠上皮细胞免受机械的磨损。 围食膜由中肠上皮细胞的分沁物形成，覆盖于整个中肠。蜜蜂围食膜的层数由幼蜂的三层可增加到成年蜂的 20 或更多层。一旦围食膜破损则细菌、病毒 975、真菌等微生物会很容易地侵入中肠上皮细胞。 4、中肠壁 上皮组织及肌肉层在一定程度上也能阻止微生物由肠腔进入血淋巴。 中肠上皮细胞膜上的电荷可阻止带有相同电荷的微生物的附着。覆盖于上皮组织上的粘膜层可以病原物丧失活动性。上皮细胞会不断的更新以替换被病原物（例如孢子虫）侵袭而遭受损害的细胞。 975；975 中肠细胞对病毒的敏感性取决于细胞膜表面所存在的特殊受体。其它影响病毒侵染的因素还有释放入肠腔中的一些干扰素或抑制物。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 3 5、气管系统 气管本身的结构可以对吸入空气中的病原物起到一定的物理屏障作用。在气管系统中相对较低的湿度及缺乏细菌生长的营养物质的条件可在一定程度上对病原物的侵入起到一 定的抑制作用。当气管系统中出现伤口，其快速有效的愈合机制及血淋巴在伤口处沉积黑色素时产生的醌类化合物均可起到抵御外界生物入侵的功效。尽管如此，气管系统也是一些细菌入侵的途径之一，例如一种壁虱专门寄生于蜜蜂的气管系统中 928，当蜜蜂为幼蜂时（小于 9 日龄）对其较为敏感，而随着齡期加大，其对壁虱的抗性也迅速提高 963。有些人认为这是由于随着蜂龄加大，其气孔周围的毛逐渐变硬，从而，在一定程度上阻碍了壁虱进入气管内部。也有观点认为随着蜂龄的变大，其气管壁逐渐变硬，不利于寄生螨吸食 寄生的血淋巴。 二、免疫应答 当昆虫的第一道屏障因磨损、受伤等原因出现伤口时，外源微生物很容易就会进入昆虫的体内。这时，昆虫体内免疫系统会立即产生免疫应答，在迅速阻塞伤口，阻挡外源物侵入的同时在体内大量合成或释放抗菌因子以杀死侵入的外源微生物。在免疫系统中，一个最首要的特征是能够分辨出哪些物质是异源物。识别自身与外源物是昆虫消灭病原物细胞或毒素并保持自身完整的关键。识别异源物是免疫应答的第一步 989； 988； 968。 由 外源微粒的二步（ 论已被广泛认可 981。这一理论认为对非生命物质的识别是通过对该物体表面物理及化学特征的检测来完成的，主要是表面电荷。对有生命物质（例如细菌）则是通过对其表面存在的特征细胞受体。也有人认为在蜜蜂体内凝集素 975； 981和苯酚氧化酶系统也参于到对外源物质的识别过程中。黑色素（产生于昆虫血液中）在外源物表面的沉积有可能是一种标记和细胞及体液防御反应的开始 1980； 982。 1、细胞防御反应 昆虫血细胞通过吞噬、成瘤或包被等方式 970可迅速降低循环系统中包括微生物在内的外源物的数量。血细胞同时也作用于血液凝块 974和伤口阻止微生物通过伤口侵入身体 986； 968； 961。 细胞免疫应答由二方面因素决定，即循环系统中血细胞的数量和种类。通常，侵染会引发血细胞出现分化并向有化学刺激的部位移动 970。例如，当蜜蜂血淋巴中侵染了一种假单中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 4 胞菌时，固生于其它组织上的血细胞会变成为可移动的进 入血淋巴，同时形状由椭圆形变成了圆形。 吞噬作用 由一些特殊类型的血细胞（吞噬细胞）将外源物开口吞掉，这在所有包括从原生动物到哺乳动物的生物体内都非常普遍。这是所有昆虫血淋巴中消除外源物一个非常重要的手段 975。 以下是吞噬的几个步骤： 化学吸引 识别 附着 吞咽 消化或吸收 在吞噬作用的最后阶段，被吞噬的细菌在由溶酶体和吞噬体组成的聚合体中被消化。溶酶体释放出水解酶（主要包括溶菌酶、碱性磷酸脂酶、核糖核酸酶及磷脂酶）破坏细菌结构。在某些情况下被俘获的细菌在吞噬体中繁殖并释放 出更多的细菌，结果造成致命的败血症。 在昆虫体内噬菌作用的有效性大小依赖于细菌的种类、血淋巴中细菌的浓度及外源物的大小和形状 1971。当血淋巴中进入大量细菌时，吞噬作用将会变为成瘤方式 983。 成瘤方式 当血淋巴中细菌数量不多时，细胞防御体系所采用的方式是吞噬作用。而当血淋巴中细菌的数量多到一定程度时将会启动一种更为有效的防御机制 成瘤方式。 简而言之，成瘤是吞噬与包被两者的结合。血细胞会大量聚集到被吞噬的细菌或被由血细胞生成的胞外基质所捕获的细菌群附近。有些情 况下，这些细菌和血细胞的集合体会被一层致密的血细胞所包裹。形成的瘤状物将离开血液循环并附着于器官表面。瘤内通常会有黑色素沉积及杀灭细菌过程中所产生的醌 985。 被包裹的细菌是否能够存活很大程度上取决于它们的毒性。一般情况下，腐生菌在黑色素大量沉积的瘤内会被迅速杀死，而某些致病菌会存活下来并最终从瘤内释放入血淋巴。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 5 包被 当外源物直径大于 10 微米，以至于单血细胞无法将其吞噬时会被包被起来。包被是指外源物被大量血细胞形成的囊状物包裹起来 1968。包被对象主要包括有寄生 虫及虫卵、真菌菌丝体及孢子、细菌或原生动物团。引发包被作用的刺激可能是外源物的表面特征或寄生虫释放的物质（代谢物或排泄物） 970。 包被作用需要粒细胞及浆细胞的参与，其中粒细胞可引发包被开始。粒细胞可释放化学因子以吸引浆细胞。首先大量血细胞组成囊膜，接着囊膜变形为仿锤形，内部有多层结构的薄膜。其细胞核退化或形成多核体。最后形成含有粘多糖的胶状物。 在有黑色素沉积的细胞包被物中，由酪氨酸一酚氧化酶反应产生的黑色素多沉淀于囊内部的多层结构上。在没有黑色素沉积的细胞包被物中，包囊仅由血细胞构成而 不含黑色沉积 970； 968。 造成被包被的寄生虫成虫或卵死亡的原因可能是窒息或是包囊内有毒废物的不断累积。包囊内黑色素产生的醌也可以对寄生虫产生毒害致死。卵会孵化不正常并发育受阻。当然，被包被的寄生虫也可能幸存并从包囊中逃脱。 还有一种无需细胞参加的防御反应 体液包被。它主要通过大量复杂的蛋白或多肽沉积于外源物质表面（主要是寄生虫及虫卵）形成包被。它是细胞防御反应的一种补充，多出现在血细胞数量不高的昆虫卵期 979。 血液凝块及伤口愈合 由于腐生菌 及致病微生物可以很容易从昆虫体表或体内的伤口进入血淋巴，因此血液凝块及伤口愈合对昆虫有效低于外来微生物的入侵意义非同寻常。 血液凝块对于伤口愈合非常重要，凝块会迅速阻塞伤口减少微生物的进入。不仅如此，在吞噬、包被及成瘤过程中也是血细胞脱粒并释放出凝集物质才能包被在外源物的表面。 当出现伤口时，大量的血细胞会聚集到伤口处并堵塞伤口。另有大量的血细胞移动至伤口处负责吞噬坏死组织、外源物质并将其消化。伤口处的血细胞可能会分化为类纤维细胞以参与伤口处的愈合 968； 1970。 从这可以看出，伤 口可以产生诱导因素（受伤因子）从而刺激血细胞向伤口处移动、加速血细胞的有丝分裂并使部分固生的血细胞成为可移动的细胞进入血淋巴 1961。这种刺激因子由受伤或病变的细胞或对外原物敏感的特殊类型的血细胞所释放。由于血液凝快块与伤口愈合能在蜜蜂受到侵染时有效保护自身，所以这两种机制也被归为细胞防御反应。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 6 2、昆虫血淋巴中的抗菌物质（体液免疫） 血淋巴是细胞和免疫蛋白通过吞噬、包被、成瘤等方式保护蜜蜂免受细菌侵入或寄生的媒介。蜜蜂体内腐生菌或致病菌的死亡归因于蜜蜂血淋巴中溶菌酶与蜜蜂肽。 与哺乳动物 的血液相同，昆虫血淋巴由血细胞（ 血浆（血淋巴）组成 968。除了糖和脂类，蛋白质是昆虫血浆中的主要组成物。一般而言，蛋白质在身体脂肪中合成并释放入血淋巴。蜜蜂的血淋巴同其它种类昆虫相类似，其中富含蛋白质与自由多肽，其中有一部分与免疫相关 1972； 989； 986。 昆虫抗菌物质的诱导产生 血淋巴的抗菌活性包括灭菌活性与抑菌活性两方面。这些具有抗菌活性的物质有些是脂肪体中部分特殊细胞合成的蛋白质；另外部分则是外 源物质诱导引起的存储物质的释放。一般而言，病原物的侵染（或实验接种外源物质）或一些不造成感染的物理或化学的因素（例如超声波、射线、生理盐水等）均会诱导抗菌蛋白的合成及抗菌活性物质的加速分泌。 屈贤铭 等用超声波处理家蚕 麻蚕（ 柞蚕（ 或直接用大肠杆菌（ 射，均可诱导这些昆虫产生抗菌物质 屈贤铭等 1984。电泳的结果表明，同一种蚕蛹经不同诱导源处理后形成相同的抗菌物质 ，而不同种属被诱导产生的抗菌物质则有明显的差异。 龚琪 等用 60的大肠杆菌及热灭活的金黄葡萄球菌和生理盐水等做诱导物，诱导美洲大蠊（ 结果表明，不同诱导源诱导产生的抗菌物质的活性大小有所不同，达到最大活性的时间亦不同。更重要的是，在抗菌特性上也有一些差异 龚琪等 1993。 刘玉滨 等用柞蚕和蓖麻蚕的蛹，棕色鳃角金龟（ 铜绿丽金龟（ 苹毛丽金龟（ 幼虫做试验，经小白鼠肝癌细胞、大肠杆菌或巨大芽孢杆菌分别诱导，均获得成功 刘玉滨等 1992。除此以外，在大头金蝇（ 王晓东等 1991、家蝇（ 王远程等1992、麻蝇（ 988a、果蝇（ 等 1990、烟草天蛾（ M 1990等昆虫上也都诱导出抗 菌物质。由此说明，在外界的刺激下产生抗菌物质是昆虫一个普遍的特性，并非某一类昆虫所独有，但诱导源却可以有所不同。从诱导源的不转移性可以推测，在控制昆虫抗菌物质基因的表达上似乎是在接受了第一信使的刺激后，有一个共同的第二信使，由它把诱导源的刺激效应传递给细胞核内的染色体上，从而引起抗菌物质基因的激活、启动和表达 翟朝阳 1996。 昆虫体内产生的抗菌物质多不具有明显的专一性并且会在几天后逐渐消失。在昆虫体内没有或极少有免疫记忆。虽然这类物质统称为抗菌蛋白 /肽，但无论是从分子量大小，还是从有关蛋白质的其它特性 （如等电点等）均存在一些差异。昆虫种类不同，其抗菌物质亦有所不同。根中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 7 据对格兰氏阳性菌和阴性菌的抑制能力一般将昆虫的抗菌物质分为四类：一类仅对格兰氏阳性菌有抑制作用，一类仅对格兰氏阴性菌有抑制作用，第三类对格兰氏阳性菌及阴性菌均有抑制作用，对细菌的作用不是直接杀伤地为第四类。在自然状况下，往往昆虫经诱导后可以产生不止一类的抗菌物质，这就是昆虫对格兰氏阳性菌和阴性菌都具有一定的免疫能力。例如 绿蝇经诱导产生的昆虫防御素 等 1989和双翅肽 988就分别对格兰氏阳性菌 和隐性菌有抑制作用。 正常血淋巴（即未出现免疫反应）的抗菌活性主要依赖于溶菌酶。 溶菌酶 作为一种杀细菌的酶，首先由 哺乳动物体内发现。 他们的研究报告中表明大量的昆虫体内也存在有溶菌酶 等 1968。不同种类昆虫其溶菌酶的生物及生化特性均非常相近。溶菌酶是一种碱性蛋白质（ 子量约为 104） ,在酸性环境下表现为热稳定，而在碱性环境中易变性。溶菌酶主要攻击格兰氏阳性菌，及个别格兰氏阴性菌，例如 正常昆虫的血淋巴中包含有少量的溶菌酶，可在昆虫表皮受到磨损或受伤时起到一定的保护作用 992。在昆虫体内溶菌酶由脂肪体合成并释放入血淋巴中。当昆虫的生理机能出现不正常时，其血淋巴中溶菌酶的活性与含量会显著提高。这种变化的诱导因素可以是病原物侵染、出现伤口或其它伤害，也可以是不利的环境条件 991； 1968； 993。 苯酚氧化酶系统 苯酚氧化酶（单羟基氧化酶）在多数节肢动物体内都有发现 986。这种酶 最初在昆虫血液内仅是没有活性的前体，在黑色素中随着代谢而表现出活性。而黑色素的出现多伴随着细胞对伤口、微生物及寄生虫侵入的应答。 当昆虫体内开始出现诸如识别外源物 978； 984； 982、细胞包被 968、体液包被 977等免疫活动时，苯酚氧化酶（邻苯二酚氧化酶）会表现出活性，结果昆虫的表皮会变硬变暗 942； 984。 天蚕素（ 昆虫中一类最主要的 抗菌蛋白。由于其首次在天蚕蛾幼虫被发现，因此被命名为天蚕素 张青文 2000 它们攻击格兰氏阴性细菌及部分格兰氏阳性菌，其中包括一些昆虫致病菌。天蚕素被认为可以攻击细菌细胞膜的脂类部分而形成微孔。尽管细胞膜总体上仍保持完整，但实际上内部已被溶菌酶彻底破坏了。天蚕素在昆虫体内主要是杀死在昆虫生活环境中大量存在的腐生细菌。昆虫的伤口极易被感染，尤其是在蛹期。多数情况下仅靠噬菌等作用无法应付大量细菌的侵入，这时昆虫就需要大量的溶菌酶及抗菌蛋白来加以补充。与此同时溶菌酶还可应付抗菌蛋白处理后所剩的一些残 余碎片。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 8 体液免疫及蜜蜂肽 当昆虫接触到有生命或无生命的诱导物时，抗菌多肽或蛋白的迅速合成是昆虫体液免疫系统 1989； 的特征。这种免疫一般仅保持几天时间且多没有专一性，主要针对格兰氏阴性细菌。通常，免疫物会诱导脂肪体中特殊免疫 合成。对应在血淋巴中会出现几种免疫蛋白。 蜜蜂营群居的社会昆虫，蜂群有大约 50000 只蜜蜂组成 张复兴等 1998，生活在一个相对拥挤，周围充满微生物的环境中，各种病原物随时威胁着蜜蜂个体的健康 周婷 1999，但蜜蜂防御系统研究的报道较少。 1977年 俄罗斯的古切娃勒恩将细菌注入蜜蜂血淋巴， 5小时后吸取血淋巴接种到肉汤平板上，培养发现蜜蜂致病的病原菌仍在繁殖，而非致病菌完全被消灭，而且这时蜜蜂血淋巴有吞噬现象，说明血淋巴内有防卫物质的产生； 1989、 1990 从蜜蜂血淋巴中先后分离了两类抗菌肽，定名为蜜蜂肽 1995）发现细菌侵入蜜蜂体内后能诱导蜜蜂血淋巴内抗菌肽类和蛋白质增加。蜜蜂肽是一组有抗菌活性的多肽，这种多肽存在于蜜蜂幼虫末期及成虫期。在实验室检测中，这种杀菌活性物质可于 蜜蜂接种活细胞（如 8小时后检测到。用墨汁或乳胶滴接种也可诱导蜜蜂肽的合成。 三、本项研究目的及意义 纵观文献，有关寄生虫侵袭引起的蜜蜂免疫机能以及国内昆虫免疫遗传学方面的工作均未见报道。在我国，蜜蜂微孢子虫及蜂螨是危害养蜂业发展的两种最主要的病害，全国因它们所造成的损失可占到总损失的 50%以上。每年蜂农为防治这两种疾病投入了大量的人力和财力。不仅如此，为防治这两种病害需要使用的包括抗生素在内的大量药物，严重污染了蜂产品，降低了蜂产品的质量。尤其随着这两年国内外对蜂产品中有毒 物质残留的不断重视，这一问题日显突出。鉴于以上情况，我们利用 1）蜜蜂微孢子虫 工感染健康蜜蜂 定发病前后蜜蜂血淋巴中血细胞数量的变化，并用 测定蜜蜂血浆蛋白总量，制作动态病理模型分析、比较感染孢子虫病前后蜜蜂血浆蛋白总量动态变化； 2）用 测定健康和螨害蜜蜂 血淋巴蛋白总量，在此基础上，采用高压超薄层等电点聚焦的方法，分析健康和螨害蜜蜂的血淋巴蛋白组分的异同。本项研究力图揭示蜜蜂血淋巴中血细胞及血浆蛋白总量与这两种病害的关系，使蜜蜂防御系统的研究工作向前迈进一步，为寻求利用蜜蜂自身免疫系统防治病虫害，从而减少药物防治的新途径打下基础。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 9 第二章 实验部分 第一部分 患孢子虫病蜜蜂血细胞与正常蜜蜂差异比较 1 试剂与材料 瑞氏染液 配制方法： 准确称取 0毫升甲醇溶液中，装瓶静置半月以上 1%次甲基兰生理盐水 血球稀释液 本所饲养的健康意蜂群。 血球计数板 光学显微镜 (10 40倍 ) 自制蜜蜂微孢子虫悬浮液，浓度： 107个孢子 /毫升 制作方法： 取患孢子虫病的成 年蜜蜂若干只，体表用 75%酒精消毒。 将蜜蜂研磨，加水稀释，纱布过滤。 将纱布上的沉淀再研磨，加水稀释，过滤，重复 2 3次，收集滤液。 滤液 3000转 /分离心 10分钟。 取沉淀，无菌水定容至 100毫升，震荡混匀制成孢子虫悬浮液。 用滴管吸取孢子虫悬浮液滴入血球计数板置于光学显微镜（ 10 40 倍）下计数，经换算后确定悬浮液稀释倍数。 2 实验方法 子虫感染 浓度为 107个孢子 /毫升的孢子虫悬液与 50%的白糖水 1： 1 混合，以一次 20 毫升剂量饲喂实验蜂群，每日一次，直至蜂群出现典型症状 。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 10 样 将患有孢子虫病典型症状的蜜蜂 3分钟。 用剪刀剪去蜜蜂头后部（注意不要剪断食管）。 等 1 2分钟血淋巴会自动涌出，用毛细管吸取 4毫升，加入 荡混匀。 取一滴滴入血球计数器，置于光学显微镜（ 10 40 倍）下计数，计算血球数量并根据稀释倍数换算成每毫升数量。 每只蜜蜂采过血淋巴后均取出中肠，研磨并置于显微镜下观察以确定为孢子虫感染。 计 分别读取 100 只患有孢子虫病蜜蜂及 50 只正常蜜蜂每毫升血淋巴中血细胞的数量，比较其平均值是否具有 显著差异。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 11 第二部分 患孢子虫病蜜蜂血淋巴蛋白含量动态变化 1、试剂与材料 考马斯亮兰染色液 配制方法： 称取 100毫克考马斯亮兰 0 毫升 95%乙醇溶液中。 加入 100毫升 冰醋酸 ，用蒸馏水定容至 1升， 4保存。 仪器： 721分光光度计（上海产） 蜂群：本所饲养健康意蜂群。 自制蜜蜂微孢子虫悬浮液，浓度： 107个孢子 /毫升 制作方法： 取患孢子虫病的成年蜜蜂若干只，体表用 75%酒精消毒。 将蜜蜂研磨，加水稀释，纱布过滤。 将纱布上的沉淀再研磨 ，加水稀释，过滤，重复 2 3次，收集滤液。 滤液 3000转 /分离心 10分钟。 取沉淀，无菌水定容至 100毫升，震荡混匀制成孢子虫悬浮液。 用滴管吸取孢子虫悬浮液滴入血球计数板置于光学显微镜（ 10 40 倍）下计数，经换算后确定悬浮液稀释倍数。 2、实验方法 浓度为 107个孢子 /毫升的孢子虫悬液与浓度为 50%的白糖水 1： 1 混合。 以一次 20 毫升剂量饲喂实验幼蜂群。每日一次，连喂 21 次。对蜂群进行感染。 采用考马斯亮蓝染色法 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 12 准确吸取 0、 升浓度为 克 /毫升牛血清蛋白标准溶液分别置于 分别加入浓度为 升的 00微升。加入 1毫升考马斯亮兰 荡混匀，静置 2分钟。 加样于 1厘米光径的微量比色皿中，波长为 595纳米，测定光吸收值（ 以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 将蜜蜂 冻 2 3分钟后，用剪刀剪去蜜蜂头后部，注意不要剪断食管。 等 1 2分钟血淋巴会自动涌出，用毛细管吸取。 收集血浆的同时，每天用光学显微镜逐只检查被采血浆蜜蜂中肠感染情况。 蜜蜂感染前每日取一份该群健康蜜蜂血浆，连续 3天。 从感染即日起，每日取血淋巴样品三份，每份约 10 12 只蜜蜂血淋巴之和，作为三个重复样。 将血淋巴加入一只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，防止血浆中苯酚氧化酶活化而使血淋巴黑化， 离心 除去血细胞。 血浆总蛋白测定采用考马斯亮蓝染色法 取血淋巴样品 10微升加入 90微升浓度为 尔 /升的 成为稀释液。 取稀释液 5微升，加入 95 微升浓度为 升的 000微升染色液。 加样于 1厘米光径的微量比色皿中，波长为 595纳米，测定光吸收值（ 根据标准曲线，结合测得的光吸收值得到样品的血淋巴蛋白浓度。 根据稀释倍数及加样量计算出样品血淋巴蛋白的量。 每个数据为 3个重复样的平均。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 13 第三部分 螨害蜜蜂血淋巴蛋白含量与正常蜜蜂的比较 1、试剂与材料 考马斯亮兰染色液 配制方法： 称取 100毫克考马斯亮兰 0 毫升 95%乙醇溶液中。 加入 100毫 升冰醋 酸 ，用蒸馏水定容至 1升， 4保存。 仪器： 721分光光度计（上海产） 蜂群：本所饲养健康意蜂群幼年工蜂一群； 本所饲养严重感染螨害的蜂群一群。 2、实验方法 准确吸取 0、 升浓度为 克 /毫升牛血清蛋白标准溶液分别置于 分别加入浓度为 升的 00微升。加入 1毫升考马斯亮兰 荡混匀，静置 2分钟。 加样于 1长为 595 纳米 ，测定光吸收值（ 以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 选择本所饲养健康意蜂群幼龄工蜂，采取其血淋巴 120 150只。 每约 10 12只为一样品，加入一只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，防止血淋巴中酚氧化酶活化而使血淋巴黑化。 共收集血样 12 份， 箱保存备用。 为了准确得到螨害蜂血淋巴，首先寻找蜂体上有 1只以上雌螨的幼蜂，再进行采血。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 14 共采集严重螨害幼蜂 120 150只 ，每约 10 12只为一样品，加入一 只小离心管，同时加入微量苯基硫脲，离心除去血细胞。 共收集血样 12 份， 箱保存备用。 蜜蜂血淋巴蛋白总量测定完毕后，样品继续 存，用于高压超薄层等电点聚焦分析。 血浆总蛋白测定采用考马斯亮蓝染色法 取血淋巴样品 10微升加入 90微升浓度为 尔 /升的 为稀释液。 取稀释液 5微升，加入 95 微升浓度为 升的 000微升染色液。 加样于 1厘米光径的微量比色皿中，波长为 595纳米，测定光吸收值（ 根据标准曲线，结合测得 的光吸收值得到样品的血淋巴蛋白浓度。 根据稀释倍数及加样量计算出样品血淋巴蛋白的量。 每个数据为 3个重复样的平均。 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 15 第四部分 螨害蜜蜂血淋巴蛋白组分与正常蜜蜂的比较 1、试验设计：血淋巴蛋白分类采用高压超薄层等电点聚焦法 2、实验原理： 蛋白质是典型的两性电解质分子，所带电荷与溶液 溶液 ，该蛋白质分子带正电荷，反之带负电荷。当蛋白质处于某一特定的 件时，蛋白质所带电荷为零，这一特定的 在等电点时，蛋白质分子 在电场中不发生移动。将蛋白质置于由两性电解质所建立起来的 度体系中进行电泳，当样品处于 高于其等电点时，带负电荷，向阳极移动，而带正电荷的颗粒向阴极移动。当样品处于 粒带静电荷为零，停止移动。样品逐步在相当于等电点 过测定即可确定被测样品的等电点。若让含有多种等电点的不同蛋白质经过电聚焦，它们会分别在相当于自己 的 置聚焦，从而达到分离纯化的目的。 3试剂与材料 仪器： 电泳仪） 2219 却设备） 试剂： 丙烯酰胺（ 甲叉双丙烯酰胺（ 四甲基乙二胺（ 16%甘油 两性电解质 %过硫酸铵（ 动剂 考马斯亮兰 5%乙醇 冰醋酸 2% 22甲基硅烷（溶剂为三氯甲烷） 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 16 1% 剂为三氯甲烷） 4方法 凝胶配置 配 方 表 成 份 1/2板用量 全板用量 30%升 16%甘油 升 两性电解质 00微升 200 微升 两性电解质 00微升 200 微升 1%过硫酸胺 100微升 200 微升 （ 1） 30% 准确称取 29克丙烯酰胺（ 甲叉双丙烯酰胺 （ 1克 加入蒸馏水 50 毫升充分溶解，过滤 定容至 100毫升 （ 2）固定液配制 用蒸馏水将冰醋酸稀释至 7% 15%（ V/V），备用。 （ 4）染色液配置 分别称取考马斯亮兰 250各 溶于 40毫升 95%乙醇中，过滤，收集滤液 滤液加入 40毫升冰醋酸，并用蒸馏水定容至 200毫升备用。 （ 5）脱色液配置 吸取 20毫升冰醋酸加于 50毫升 95%乙醇中 用蒸馏水定容至 200毫升备用 中国农业科学院硕士学位论文 寄生虫感染后蜜蜂血淋巴中血细胞及总蛋白的动态变化研究 17 电泳 （ 1）玻璃板的处理 将水平制胶模具中的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂用擦镜纸均匀涂布于玻璃板表面，室温放置干燥后用去离子水冲洗表面去掉水滴备用。 （ 2） 制胶 将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上，膜两侧边缘放置隔片带 ( ),将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上 ,固定。凝胶液 (丙烯酰胺 载体两性电解质 (6： 4： 1)经充分脱气处理后，加 1%混匀沿平板一端灌入，勿使产生气泡，凝胶凝固后，去掉玻璃板待用。 （ 3）预电泳 将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央， 4 预冷 30分钟。将电极条分别用阴、阳极电极液充分湿润，去掉多余电极液后，平行置于凝胶两端。电极垂直平置于电极条上，保持适当的压力。500伏预电泳 2小时。 （ 4）加样 先将滤纸片 (米 )排放在距阴 极端 2或 3厘米处，分别取健康蜜蜂血淋巴的样品溶液及螨害蜜蜂血淋巴的样品溶液各 4微升加在滤纸上。 （ 5）电泳 循环水温度： 4 电泳仪电压： 2000伏 电泳仪功率： 25 瓦，最后 0瓦 电泳时间为 凝胶固定 将凝胶板浸没于固定液中固定 1小时 凝胶染色 将凝胶板浸没于染色液中 染色 20分钟 凝胶脱色 将凝胶板浸没于脱色液中过夜 中国农业科学院硕士