【毕业学位论文】（Word原稿）马传染性贫血病毒基因转移载体系统的构建及分析预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 马传染性贫血病毒基因转移载体系统的构建及分析 D. 摘 要 慢病毒如 同 其它逆转录病毒，可以 将前病毒基因组 持久地整合到感染细胞的染色体上并且在感染的细胞和子代细胞中表达病毒基因，可以作为将目的外源基因引入细胞的载体。 由于 慢病毒除了能够感染分裂状态的细胞外还具有 感染 非分裂细胞 的 能力 ，因而，慢病毒载体备 受关注 。 以基础的慢病毒 基因转移载体是目前研究最为透彻的慢病毒载体。尽管已经 在 增加 体的生物安全性和减少产生 具备 复制能力的病毒 方面 做了很多改进 ，但要 应用于人类临床实验 仍然存在较大的 安全 隐患 。 因此，开发 非灵长类慢病毒 基因转移 载体 系统成为当前研究的热点之一 。 马传染性贫血病毒（ 一种非灵长类慢病毒，而且是 基因组结构最简单的慢病毒。中国 白细胞弱毒疫苗株（ 目前唯一成功开发并大规模应用的慢病毒疫苗。 本 研究的目的在于利用我国在马传染性贫血病毒（ 究上的成果，在 白细胞弱毒疫苗株的感染性克隆（ 基础上，构建有中国特色的 基因治疗、疫苗的开发和马传染性贫血病毒或其它相关的病毒的致病机制和免疫机制的研究提供一个新的研究手段。 本实验 利用反向遗传操作技术，以 白细胞弱毒疫苗的感染性克隆质粒（ 基础 ，用 即早期启动子替换了 ，以及载体中加入内部启动子、乙型肝炎病毒转录后调节元件（ 中央聚嘌呤序列 （ （ 载体进行修饰，构建了系列复制缺陷性 体质粒 。 同时将 因片段插入不同真核表达载体中构建了囊膜缺失的 达质粒 。 而且克隆水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白（ 因并构建了不同的提供囊膜伪型的 真核表达载体质粒，建立了 质粒基因转移载体系统。 实验结果表明用 即早期启动子替换了 的复制缺陷型 体转染或制备的载体病毒转导 293T 细胞能够有效地表达报告基因 具有内部启动子载体转染后 表达明显高于无内部启动子的载体，说明增加一个内部启动子能够提高转基因的表达。反向插入 载体转染后未见有 表达，表明反向插入 表达 ， 而这种抑制作用可以被 纠正。 正向插入 载体转染后 未见对 表达 有明显的抑制作用，说明 作用是方向特异性的。载体中增加中央聚嘌呤序列（ 应元件（ 用元件能够明显地增加报告基因的表达。构建的 达载体在 因前增加一个 内含子能够明显地增加 表达，而 达载体却得出相反的结果，说明内含子可以增加 达载体的蛋白表达，但是不能增加 体的蛋白表达。 关键词：慢病毒载体，马传染性贫血病毒，水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白，乙型肝炎病毒转录后调节元件，中央聚嘌呤序列 to NA of be to of of be as to In to to on (by to to of to of is a is a of up to is to on an to a of of A of of by 93T or of of is in be by An MV MV in I 目 录 1前 言 . 1 因 转移载体 的类型 . 1 病毒的分子生物学特性 . 3 病毒载体系统的组成 . 5 因转移载体 . 6 病毒载体的包装系统 . 7 病毒载体的囊膜伪型化 . 9 病毒转移载体系统的技术进展 . 10 病毒转移载体的改进 . 10 装系统的改进 . 12 病毒载体的靶向研究 . 13 病毒载体的应用 . 14 因治疗 . 14 苗研究 . 15 础实验研究 . 15 传染性贫血病毒与马 传染性贫血病毒基因转移载体系统 . 16 研究的主要内容和意义 . 18 2 材料和方法 . 20 毒和细胞 . 20 粒和菌株 . 20 剂 . 20 物的合成 以及 克隆或者亚克隆片段的序列测定 . 20 粒的提取与纯化 . 20 粒的小量提取 . 20 粒的大量提取和纯化 . 21 . 22 . 22 . 24 . 24 列分析 . 24 乙型肝炎病毒（ 录后调节元件 (克隆 . 24 胞 提取 . 24 增 . 24 克隆测序和分析 . 25 因转移载体系统的构建 . 26 体质粒的构建 . 26 达载体的构建 . 29 达载体的改造 . 31 达载体的构建 . 35 染及载体病毒的制备 . 35 染 . 35 体病毒的制备 . 36 体病毒介导的基因转移 . 36 测 . 36 白表达的检测 . 36 3 结 果 . 37 因转移载体系统的构建 . 37 毒囊膜基因表达载体： 达载体 . 37 因转移载体的构建 . 45 达载体的构建 . 52 组 达载体转染后的转录和表达 . 56 组 达载体的转录 . 58 组 达载体的表达 . 58 达载体转染后的表达 . 58 体转染后增强绿色荧光蛋白（ 表达 . 61 体单 独转染 293T 细胞后报告基因 表达 . 61 质粒 体系统共转染 293T 细胞后报告基因 表达 . 61 因转移载体转导 293T 细胞 . 63 4 讨 论 . 65 于构建 达载体的 毒株属于 清型 . 65 含子对 达载体和 达载体的作用 . 67 建的基因转移载体能够有效地转录和表达报告基因 . 67 乙型肝炎 病毒 转录后调节元件（ 因转移载体 的 调节是方向特异性的 . 70 央聚嘌呤序列 （ 和 反应元件（ 够增加体转基因的表达 . 71 因 的基质蛋白（ 码区中单个碱基的缺失 可能 影响 达载体蛋白表达 . 72 响构建的 因转移载体转导效率的原因 . 73 5 结 论 . 75 参考文献 . 76 附录 ： 因转移载体系统构建过程中重组质粒的核苷酸序列 . 93 致 谢 . 123 作者简介 . 124 中国农业科学院 博士学位论文 前 言 1 1 前 言 基于 基因转移载体技术的基因治疗是指通过载体将外源基因导入受体细胞，利用该基因或其编码 产物来纠正基因紊乱和减缓疾病进程，从而达到治疗疾病的目的。 1990 年 首次将此项技术应用于治疗 先天性 腺苷脱氨酶缺陷病，并进行了 I 期临床实验（ 1995），这是现代分子医学发展史上的一个新的里程碑。目前基因治疗已经成为现代实验医学中发展最快的领域之一，表现在应用基因治疗的范围在不断地扩大、转移载体系统的种类在不断地增加、以及转移载体技术在不断地改进，这使得基因转移载体技术应用于基因治疗的潜力越来越大，在新的世纪必将会对人类的健康产生重要的影响。此外，基因转移载体技术正在成为改进疫 苗设计和基础实验研究的强有力工具。 因 转移载体 的类型 根据载体自身的特性可将目前使用的基因转移载体分为两大类：第一类是 病毒载体 系统，是利用各种不同的病毒传递外源基因，使其持久地整合到宿主细胞的染色体中或者伪装成独立的单位。第二类是 非病毒载体系统 ，是指通过物理的或者化学的 方法 将 “裸体” 因和 阳离子脂质体 混合物、或者 多聚赖氨酸 合物 ） 直接传递到宿主细胞（ 978； 2004； 1994； 1992； 1993）。通过物理方法进行的基因转移可以使 过细胞膜后直接进入细胞核，由于不经过内涵体 /溶酶体 体 系，从而可以避免酶的降解。如通过基因枪、电穿孔和一种称为核转染（ 术的新的电穿孔方法可以将裸体 接传递到细胞核（ 2004.）。这种非病毒载体系统具有无感染性、毒性低、传递的 段大等优点，但是由于非病毒载体的转染效率低（尽管可以通过化学和物理的方法增加 摄入和表达）、缺乏特异性的靶向、转基因只能瞬间表达以及体内应用困难等因素限制了其在基因治疗 和临床前实验研究中的应用（ 1999）。 病毒载体又可以分为 逆转录病毒载体 和 非逆转录病毒载体 。目前已经用于临床实验或者正在进行临床前基因传递特性研究的非逆转录病毒有腺病毒、腺相关病毒（ 痘苗病毒、金丝雀痘病毒、单纯性疱疹病毒（ 巨细胞病毒（ 毒、负链 毒（如流感病毒、水疱性口炎病毒）、甲病毒（ 疹病毒载体等（ 003； 1996； 1997； 1998； 1992； 1996； 000； 996； 1996； 996； 1994； 996； 1999； 1994； 1996； ）。这些病毒载体尽管有其各自的优势，但也各有缺陷，诸如基因结构复杂、容纳外源基因的能力有限、不能使外源基因整合和持久稳定地表达以及会引起宿主出现免疫反应、炎症和毒性反应等（ 1999； 2000； 2000）。 逆转录病毒能够有效地将外源基因整合到宿主细胞的染色体中，使被转移的靶基因随宿主细中国农业科学院 博士学位论文 前 言 2 胞染色体的复制而复制，从而使外源基因能够在宿主细胞中有效、持久、稳定地转录和 /或表达，这一特性使其成为倍受关注的转移载体病毒。 逆转录病毒可以分为两类：简单的逆转录病毒（ 致瘤性逆转录病毒）和复杂的逆转录病毒，前者主要是鼠白血病相关病毒组（例如，鼠白血病病毒 ，后者包括慢病毒和泡沫病毒。致瘤性逆转录病毒载体如小鼠白血病病毒（ ，是目前临床上应用范围最广的转基因传递工具（ 997）。其优点在于：（ 1）具有介导在靶染色体中稳定整合的能力，大部分情况下具有增强传递的转基因在宿主细胞中长期表达的能力；（ 2）较大的克隆容量，可以应用于目前可预测的大多数临床疾病的治疗；（ 3）伪型的兼容性扩展了基因传递的细胞嗜性范围；（ 4）由于缺少病毒基因，只有传递的治疗性转基因在宿主细胞中表达，从而排除了体液免疫反应清除转导细胞的可能性，而且这种载体能够反复应用。但是致瘤性 逆转录 病毒不具备转导非分裂细胞的能力。复杂的逆转录病毒除了具 有简单逆转录病毒的上述优点外，还具备转导非分裂细胞的能力。由于有些基因治疗的靶细胞不具备分裂能力或只有有限的分裂能力如造血干细胞，而且即便是肿瘤细胞也不是在任何时刻都分裂，因此这一特性对于基因治疗是非常重要的。目前已经有许多研究人员构建了泡沫病毒基因转移载体系统（ 1997； 1996； 1996； 1995.），并且应用泡沫病毒载体对泡沫病毒的 用元件进行了鉴定（ 1998.）。但是有关泡 沫病毒载体的报道还是十分有限，人们对泡沫病毒性质的了解也还不够清楚。 病毒能够感染非分裂细胞，即分化的哺乳动物细胞的这一特性使它成为更具潜力的基因传递工具。以2002； 1998；1998.）。尽管已经在增加 要应用于人类临床实验仍然存在较大的安全隐患。鉴于此， 人们开发了许多其它灵长类和非灵长类慢病毒基因转移载体，包括 1998； D2001）、猴免疫缺陷病毒（ 2000； 2000）、猫免疫缺陷病毒（ 2000）、牛免疫缺陷病毒（ 2001b）、 毒（ 2000）、羊的 2001a）、山羊关节炎脑炎病毒（ 1998）、马传染性贫血病毒（ 999； 998）。尽管人 致病性不如 是灵长类慢病毒载体仍然存在着临床应用的安全性问题。如果灵长类慢病毒载体同细胞中内源性逆转录病毒或同瞬时感染期间存在的外源性病毒重组就会增加产生具有复制能力的 且还有可能使载体转移到病人的其 它 细胞。而对于非灵长类慢病毒载体，这种重组几乎不可能发生。因此， 非灵长类慢病毒载体 系统成为当前研究的热点之一。 此外，新近又开发了由复杂的非逆转录病毒和逆转录病毒 /慢病毒构成的 嵌合病毒载体系统，如 转录病毒载体、 逆转录病毒载体、腺病毒 /逆转录病毒载体、 腺病毒 /慢病毒载体 、 转录病毒杂交载体、痘病毒 /逆转录病毒载体 等 （ 1999； 1997； 1996； 1999； 1999； 2003； 中国农业科学院 博士学位论文 前 言 3 2003.）。 病毒的分子生 物学特性 慢病毒隶属于逆转录病毒科，具有逆转录病毒所特有的形态特征，即病毒粒子的核心有两个相同的单股正链 子和病毒复制所需的酶，外层由宿主细胞膜和病毒的囊膜糖蛋白组成的病毒囊膜所包围。但是在形态发生学和形态学上，所有的慢病毒又具有不同于其它逆转录病毒的共同特征。从质膜出芽释放的慢病毒可以是不具备病毒核心的病毒粒子即未成熟的病毒粒子，典图 1 慢病毒的基因组成 of R. C. 2001.). 中国农业科学院 博士学位论文 前 言 4 型的成熟病毒粒子具有一个锥形或者杆状的病毒核心。所有已知慢病毒的基因组都具有 因，此外慢病毒还至少有 3 个调节 /辅助基因（图 1）。 因是 所有 6 种慢病毒共有的。 白对于 因的有效表达是必需的。 以激活 的启动子，有利于产生病毒 病毒 互作用，可增进病毒 ，其它慢病毒均具有 因。慢病毒的这些辅助基因赋予慢病毒更为复杂的复制周期。 慢病毒复制周期的一般特性见图 2。病毒粒子通过病毒囊膜糖蛋白和细胞受体之间特异的相互作用吸附于易感靶细 胞的表面，然后病毒囊膜和细胞的质膜融合，将病毒核心释放到细胞质中。病毒进入细胞后，在细胞浆中部分脱衣壳，并启动病毒 反转录成双链 分反转录图 2 复制周期。 E. O., . A. 2001). of to D4 ). In ) is a of in ) of in of ), NA is to ), ) is by a of a NA as a NA I) to of ) in of ) ag ) to as 0). by 1) a 20 is 2). 中国农业科学院 博士学位论文 前 言 5 的双链 物与病毒的 白组成核蛋白 该复合物随后经过细胞浆被运输到细胞核。慢病毒复制过程中的这些早期步骤需要大量细胞因子的参与。反转录产生的全长的病毒 以以前病毒形式持久地整合到细胞染色体 ，这是有效地合成病毒产生感染性病毒粒子的必需步骤 ( 1998.)。整合的前病毒 细胞周 期复制，如同细胞基因，可以传给子代细胞。这种特性使得逆转录病毒载体具有将外源基因持久地导入细胞的能力。慢病毒复制过程中产生的 过核输入机制主动转运到非分裂细胞的细胞核中，此时细胞正处于细胞 的分裂间期，这一过程是慢病毒所特有的。整合的前病毒 为模板在 合酶 I)的指导下转录出病毒的 需要病毒编码的 白和细胞转录激活蛋白的参与。未拼接的和部分拼接的慢病毒转录体通过慢病毒特有的 白介导的核输出机制运输到细胞质，在细胞质中被翻译成病毒蛋白。病毒前体结构蛋 白和复制酶与病毒 配形成新的病毒粒子核心，然后从细胞膜以出芽方式获得病毒囊膜糖蛋白，进一步加工前体核心蛋白，最后形成成熟的、具有感染性的子代病毒颗粒。慢病毒的一些辅助蛋白对于病毒的复制并非是必需的，譬如， 它们可以影响病毒的感染性。 在感染的细胞中，慢病毒从位于前病毒基因组 5（上游）长末端重复序列（ 的病毒启动子转录出单一的前体 3 游带有转录终止信号和多聚 A（ ）尾。 因编码病毒结构蛋白， 因编码病毒复制所需的酶类。这两个基因首先以 毒蛋白酶自我裂解 体，进而加工 白产生蛋白酶（裂解病毒前体蛋白成为成熟的蛋白）、逆转录酶（复制病毒核酸）以及整合酶（介导病毒基因组整合到染色体 白被进一步裂解产生逆转录病毒共有的病毒核心组分（基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白）和特定病毒特有的辅助核心蛋白（ 期蛋白）。因编码病毒囊膜糖蛋白，经细胞蛋白酶断裂成外部的囊