【毕业学位论文】（Word原稿）RNA干扰介导抑制家蚕核型多角体病毒（BmNPV）增殖的研究特种经济动物饲养硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 扰介导抑制家蚕核型多角体病毒（ 殖的研究 on of I on of 要 为了探讨利用 制病毒复制、增殖的效果，选取家蚕核型多角体病毒（ 复制具有关键作用的极早期表达基因 旋酶基因 及对细胞释放型病毒（ 平传播具有关键作用的病毒囊膜蛋白 基因 靶基因，体外合成了与其相对应的 脂质体转染家蚕 胞 ,感染病毒粒子或共转染病毒基因组 究比较了供试 制、增殖的抑制效果，探讨 子大小以及同时抑制 2 个基因表达对病毒滴度的影响，筛选最佳标靶基因序列， 为结合利用转基因技术和 术进行家蚕抗病毒研究提供依据。本文的主要研究内容如下： 一、 因相应 家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据 人工设计并体外合成了长度为 438 利用脂质体转染家蚕细胞，研究其对 果表明该 大抑制效果是病毒滴度比对照 降低了 1 处理区病毒增殖过程被完全抑制的有效作用时间是 2 二、 因相应 家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据 工设计并体外合成了分别位于 个1、 度分别为 459、 508、 337 以及 个 3度分别为 122、 105、 109用 殖的抑制效果并进行比较分析。结果表明 6个供试 3个长片段 制效果没有明显差别， 最大抑制效果为病毒滴度比对照 降低了 小片段 毒滴度抑制效果在感染后 24h、 96双峰型曲线， 与推测的 有表达相一致。 三、 解旋酶 基因相应 家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制研究 根据 旋酶基因 列， 体外合成了长度为 427 经脂质体转染家蚕细胞后研究其对 果表明该 大抑制效果为病毒滴度 降低了 四、 抑制不同靶基因对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果比较 在相同条件下，分别将 应 染 究各 结果表明 3个 殖的抑制效果的 大小顺序为 3为 制 佳靶基因。利用 制 个基因与抑制单个基因进行比较，表明同时 抑制 个基因的病毒滴度介于对 2个基因单独抑制的病毒滴度之间，未发现协同增效作用。 关键词： 扰，双链 蚕核型多角体病毒，增殖，抑制 o on we (, as in in NA mN by of on of of of on as on in of in 1. of of on to of in 38 bp in NA mN by 04 g NA mN 2. of of on on in RF 59 08 3(337 in 3 32205 309 mN of of NA 1, G2 3 03.5 333-3 to or 4 6 of on of is at at 3. of of on on of 27bp in NA mN by of of on To of on of 1), 3), 1) 1 1 mN 11, is of of 1 1 of t 录 第一章 绪论 1 发现与发展 1 相关因子及机制模型 2 相关因子 2 机制模型 3 作用特征 4 有高度的特异性 4 应具有高效性 4 在放大效应 4 生效应的中介分子 4 要 与其效应 4 他的沉默机制 4 录水平基因沉默 4 导内在的 5 生物学功能 5 病毒感染免疫 5 持基因组中转座子的稳定性 6 除异常 6 V 因表达调控 6 1.6 生成方式 7 过 赖的 合酶合成 7 座子产生 7 建表达 质粒转入细胞表达 7 1.7 生成方式 8 学合成 8 外转录法 8 内载体表达法 8 外酶切法 8 术在哺乳动物、昆虫中的应用 9 术在哺乳动物中的应用 9 术在昆虫中的应用 9 结 10 第二章 研究目的与意义 11 第三章 一般实验材料和方法 12 验材料 12 粒和菌种 12 虫细胞 12 试剂及试剂盒 12 它主要试剂 12 菌培养基 12 虫细胞培养基 12 用溶液及缓冲液 13 用主要仪器和设备 14 般实验方法 14 胞的传代 14 胞的冻存 14 胞的复苏 14 胞计数 14 因组 共转染 15 染后病毒母液感染细胞 15 毒滴度测定 15 度测定 15 度测定 15 因组 取 16 应 16 法少量快速抽提质粒 16 法大量制备质粒 17 制性内切酶反应 17 段的分离与回收 17 6 连接 18 粒 转化 18 组质粒的鉴定 18 用 司 行体外转录 19 第四章 因相应 家蚕核型多角体病毒（ 制 增殖的抑制研究 20 料与方法 20 试验材料与试剂 20 病毒扩增及 因组 提取 20 引物的合成 21 增 21 因部分片段的克隆及测序 22 外转录合成 1 22 胞转染 22 因组 共转染 22 1 转染的 细胞用病毒母液感染 22 毒滴度测定 22 毒滴度（ 计算方法 23 果与分析 23 因组 提取 23 1 的制备 23 1 与 转染对病毒增殖的抑制效果 23 1 转染对病毒粒子感染增殖的抑制 23 论 26 第五章 因相应 家蚕核型多角体病毒（ 制 增殖的抑制研究 29 验材料与试剂 29 法 29 毒扩增及 因组 提取 29 物的合成 29 外合成大片段 31 外合成小片段 31 胞转染 32 毒滴度测定 32 果与分析 32 因组 提取 32 片段 制备 32 增长度为 100右的 因片段 32 片段 制备 32 1、 染对病毒粒 子感染增殖的抑制 33 3 与病毒基因组 转染对病毒增殖的抑制效果 33 包埋脂质体用量与 3 对病毒粒子增殖抑制效果的关系 34 片段 染对病毒粒子感染增殖的抑制 34 论 35 第六章 解旋酶基因相应 家蚕核型多角体病毒（ 制 增殖的抑制研究 40 验材料与试剂 40 法 40 毒扩增及 因组 提取 40 物的合成 40 因部分片段的克隆及测序 41 外转录合成 1 41 染的细胞用病毒母液感染 42 毒滴度测定 42 果与分析 42 因组 提取 42 扰用 制备 42 1 转染对病毒粒子感染增殖的抑制 42 论 42 第七章 抑制不同靶基因对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果 比较 44 料与方法 44 生物材料与试剂 44 细胞转染 44 病毒滴度 测定 44 果与分析 44 染 病毒粒子感染增殖的抑制比较 44 染 1 对病毒粒子感染增殖的抑制分析 46 论 48 第八章 全文结论 49 8.1 因相应 制增殖的抑制 49 因片段克隆与体外转录合成 49 1 转染对病毒粒子感染增殖的抑制 49 8.2 因相应 制增殖的抑制 49 外转录合成较长片段的 49 外转录合成较短片段的 49 因长片段 病毒粒子感染增殖的抑制 50 片段 染对病毒粒子感染增殖的抑制 50 期基因 应 抑制效果 50 因片段克隆与体外转录合成 50 染对病毒粒子感染增殖的抑制 50 制不同靶基因对 殖的抑制效果比较研究 51 埋 脂质体的用量对滴度抑制效果的影响 51 参 考 文 献 52 致 谢 57 附录 58 硕士期间发表的论文 68 作者简历 69 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 NA 扰 链 干扰 链 发卡状 识别、剪切 酶 录后基因沉默 导的沉默复合体 NA NA 导的 合酶 蚕核型多角体病毒 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第 一章 绪论 发现与发展 1990年 ， 行了研究 ， 尝试加深花朵的颜色。他们将一个能产生色素 (基因前加上一个强的启动子后 ， 转入矮牵牛 （开紫花） 中 ， 结果没有看到期待的深紫色花朵 ， 多数花朵成了开紫花有白斑甚至全白色。因为导入的基因和其内源基因同时被抑制，所以 et 1990；et 1996。在病毒感染的植物中也发现同源 为病毒诱导的基因沉默（ 1994年 ， 入野生型粗脉孢霉 (， 发现大约 30的 转染细胞 的 内源性 当时称这种现象为压制 “et 1996。以后陆续发现昆虫和哺乳动物中均有转录后基因沉默（ 是进化过程中非常保守的生命现象。 et 999 首次发现 1995年 ，美国康奈尔大学的研究人员 于线虫第一次卵裂是不对称的 ， 所形成的子细胞的大小、胞浆成份、以后的发展命运都不相同。 们注入反义 使之与 而阻断蛋白的翻译过程，达到阻断 果发现反义是作为对照的正义 也同样阻断了该基因的表达 et 1995。这种现象与反义 1998年，华盛顿卡耐基研究院的 4和 过电泳纯化后 注射到线虫中，结果发现只有微弱的基因抑制作用。而将纯化后的 义链和反义链的混合物）注入线虫，发现 且抑制基因表达的效率比单链 个数量级。他们推测正义来的实验表明在线虫消化道中注入会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为 简称 (et 1998. 1999 年， 报道：在外源基因或病毒基因诱导产生 植物中发现大小均一的约 25 对核苷酸的 在无 植物中没有检测出 et 999。在果蝇、哺乳动物的 验中发现长 赖的酶剪切加工成小分子干扰 et 001; et 000; et 000，现在已经证实 跨种属的介导 关键因素，并与特异性识别同源靶序列密切相关。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 相关因子及 机制 模型 相关因子 启动因子 家族成员。在线虫、果蝇、真菌、拟南芥中结构保守。 et 001； et 002; et 001。氨基端解旋酶域；两个 化区，参与 一个一个 区为含 110氨基酸，可与 与 NA(工成 效应因子 一种与 有核酸内切、外切酶活性，能识别、结合目标 切 辅助或直接参与 以认为后者的形成起源于前者的形成，从 2005; et 2005 在人类细胞中，已经被确认为 蝇 虫 其中， 一庞大的蛋白家族，许多真核生物中有若干同源体，目前已确认人类有 8个，果蝇有 5个，线虫有 27个，同源体的功能有所差别，有些参与 些参与 果蝇的 现 一步用 现其含两个 of 其中， 拟南芥、线虫、哺乳动物中是同源的 et 2002。人类的 沉默可导致 是 体外培养细胞中，用 得到以下推测： 影响 并非 维持其稳定性； 是一种与 括两个亚型，两者均与 果蝇中 2时可连接 果匹配完全， et 2001; et 2003；如果匹配不完全，则通过et 003 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 大效应所必需 生化和遗传研究表明 ， NA 增强 001， 即以 同时复制触发性 有的产物又可作为 始 et 2001观察了依赖于 FP 用果蝇的非细胞系统提取物，在没有靶 发性 全长的靶 被假定存在于胚胎提取液中的 后将从上述反应混合物中纯化的 可在一种非 绿色荧光素酶的负向调控下有效地靶向 进一步研究发现，用 32FP 结合，这个实验表明 合成的全长的 0分钟之内就能形成，并在几个小时内被 一个合成的 合成的 端延伸，由此可以推定 在线虫、真菌和植物系统中 导的 需 et 1999; et 2001; et 2001。 et 2001认为 达到一个临界浓度后， 是进一步扩增 合成的 后，新合成的 义链所引发进入下一个 而解释了 机制 模型 通过生化和遗传学研究， et 2001提出了以下的 这一机制模型包括起始阶段和效应阶段。起始 阶段 ， 在 加入的 ， 以一种 毒感染等各 种方式引入的双链 割将 1每个片断的 3 端都有 2个碱基突出。在 激活 活的 到同源 然后 先 酸酶在 结合原先的 置切割 生新的 核酸酶形成复合物，继续对目的 而使目的基因沉默。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 作用特征 有高度的特异性 对其它基因没有影响 et 2002。 应具有高效性 相对很少量的 数量远远少于内源 就能产生强烈的 个细胞仅需几分子小干涉 可产生 可达到缺失突变体表型的程度 et 2001。而且， 的甚至可以传递数代 et 2000。 在放大效应 通过线虫、果蝇、小鼠等的 实验研究发现，少量的 表明括 行 沉默信号的扩增等 et 2002。 生效应的中介分子 长 1者为降解靶基因的中介分子，并决定 et 2001。