【毕业学位论文】（Word原稿）PRRSV CH-1R株黏膜免疫效果的测定及其ORF5的遗传变异分析动 物 病 毒 分 子 生 物 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 黏膜免疫效果的测定及其 of of of of I 摘 要 本研究选用 6 周龄大的长白系杂交仔猪，用于 弱毒株黏膜免疫效果的测定。通过临床症状、病理学变化和抗体分布的检测证实了 毒 株 经 鼻 腔 免 疫 的 安 全 性 和 黏 膜 免 疫 反 应 。 而 且 我 们 还 检 测 了 经 鼻 腔 免 疫弱毒株的仔猪的 体水平、 1 细胞因子水平等方面。通过研究表明，弱毒免疫组的某些组织器官在临床剖检和组织病理学上有一定的变化，但与强毒组相比程度较轻；间接免疫荧光试验结果显示，免疫组明显比对照组和强毒组的荧光反应 要强； 鼻灌洗液和肺灌洗液中，免疫组水平在免疫后随时间的延长，呈现上升趋势，攻强毒后， 平明显升高；免疫组血清中， 胞因子 水平随免疫时间的延长，在免疫第 14 天前是呈上升趋势的，从免疫 14 天后呈下降趋势，攻强毒后， 胞因子水平在攻毒后前 7 天时呈快速上升，并且上升速度比免疫前期快，但在攻毒 14 天后已经开始下降； 胞因子水平随免疫时间的延长，变化与对照组基本一致， 体水平随免疫时间的延长，从免疫 14 天后呈上升趋势，在免疫 35 天后达到平台期，攻强毒后， 体水平明显升高，并且上升速度比免疫前期快。 综合所有的检测结果我们认为，经鼻黏膜免疫接种 弱毒疫苗，可以刺激机体产生较高的黏膜免疫反应和体液免疫反应，有效的保护易感动物。 在进行动物免疫试验的同时，本研究选取了 10 个不 同 代 次 的 和病毒利用 增 因 ，并与其它 8 株序列进行序列比对，分析 致弱过程中的遗传变异情况。 因的变异分析显示，该致弱毒株与 以及其它 8 株参考毒株存在着差异， 因同源性在 而且 系统进化树研究表明，该弱毒株仍属于 群。通过软件对其所编码的 白的氨基酸序列比较，我们发现相对于 ， 病毒在第 38 位的氨基酸由变为了 病毒在第 146 位的氨基酸由变为了 、 和 病毒未发生改变， 并且上述 10 个代次与参考毒株的氨基酸的同源性在 间。通过对序列进行 析，发现了一个特异性的内切酶酶切位点 根据该酶切位点，可以区分 、 、其它野生型毒株和参考毒株。 关键词： 膜免疫， 传变异 o of H of H by of we of gA FN GF of H of to by H of of In of H we of to as we to of in In of le of 4 5 th in 4 it of in in of gG as 14 it to 5 it gG in we of H in At we 0 H in to to H of to To we 70 H 85, 130 8th is 120, 130 46th eu 39, 65 of 0 in a be to H 录 第一章 绪论 . 1 繁殖与呼吸综合征的研究进展 . 1 繁殖与呼吸综合征病毒 简介 . 1 基因组成及生物学特性 . 2 遗传变异 . 2 免疫 . 4 膜免疫系统 . 5 膜免疫系统诱导部位的免疫细胞及功能 . 6 膜免疫系统效应部位的免疫细胞和功能 . 7 同黏膜免疫系统 . 7 液免疫机制 . 8 结构和功能 . 8 膜细胞因子 . 9 膜免疫途径 . 9 膜免疫系统在预防 猪繁殖与呼吸综合征的研究 . 10 究目的 . 10 第二章 毒株对仔猪黏膜免疫效果的测定. 12 料与方法 . 12 毒与试剂 . 12 要仪器 . 12 验动物 . 12 验方法 . 12 料采集 . 12 织病理学观察 . 13 接免疫荧光试验 . 13 测 体水平 . 13 测血清中细胞因子 平 . 14 测血清中细胞因子 平 . 14 测 体水平 . 15 验结果 . 15 V 床剖检症状 . 15 织病理学变化 . 15 接免疫荧光试验结果 . 15 测鼻灌洗液中的 体水平 . 16 测肺灌洗液中的 体水平 . 16 测血清中细胞因子 平 . 17 测血清中细胞因子 平 . 18 测血清中的 体水平 . 18 论 . 19 第三章 毒株致弱过程中 因的遗传变异分析 . 22 料与方法 . 22 毒与细胞 . 22 验材料 . 22 物 . 22 毒的传代培养 . 22 毒 提取及 . 22 段的回收和测序 . 23 析和序列分析 . 24 结果 . 24 毒 鉴定结果 . 24 因的序列测序和同源性比较 . 25 因的进 化分析 . 25 段的 析 . 26 码的氨基酸序列的变异和同源性分析 . 27 码的氨基酸序列的糖基化位点分析 . 30 讨论 . 31 第四章 结 论 . 33 参考文献 . 34 附 录 . 39 1 病理图片 . 39 组织间接荧光试验结果 . 42 3 常用溶液的配置 . 45 致 谢 . 48 作 者 简 介 . 49 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 繁殖与呼吸综合征 繁殖与呼吸综合征病毒 酸脱氢酶病毒 动脉炎病毒 放阅读框架 抗体依赖性增强作 用 肺泡巨噬细胞 限制性内切酶多型性 细胞介导的免疫反应 膜免疫系统 黏膜相关淋巴组织 ut 道相关淋巴组织 支气管相关淋巴组织 鼻相关淋巴组织 皱褶细胞 原递呈细胞 突状细胞 共同黏膜免疫系统 皮内淋巴细胞 分泌片 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 的 研 究 进 展 猪繁殖与呼吸综合征（ 由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ 起的，以母猪的繁殖障碍、哺乳仔猪的高死亡率及呼吸症状为特征的一 种传染 病。 该病 1987年在 美国首 先发生， 随后在 世界 各主要养 猪国家 流行。我国 1996年由郭宝清等首次报道该病，研究证明其为美洲型（ 郭宝清 等 ， 1996）。目前该病 在我国 大部 分地区均 有流行 ，给 养猪业造 成了巨 大的 经济损失 （ 蔡雪辉等 ， 2000）。 本病的主要临床症状为发病母猪出现发热、厌食、流产、弱产及木乃伊胎；种 公猪出 现性 功能下降 ，精液 质量 和精子活 力下降 ；仔 猪和育肥 猪表现 呼吸系统疾 病症状 ，呼 吸困难、 急促、 呈间 质性肺炎 、耳部 和肢 体发绀。 本病极 易引起继发 感染， 从而 加剧病情 ，使死 亡率 升高。如 果猪是 首次 感染发生 此病， 可导致严重的经济损失。 目前， 常继发细菌或其它病毒感染，使临床症状变得更加复杂。 且出现严重的生殖减退现象（赵得明等， 1999）。 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 简 介 1991年， 猪繁殖与呼 吸综合征病毒 （ 荷兰的莱利斯塔镇首次分离鉴定 （ et 1991）。 的 单股 正 链 与乳 酸脱氢酶病毒（ 马动脉炎病毒（ 在核苷酸序列、基因结构、致病机制等方面都存在极大的相似性（ P， et 1995），同 属于 第 10次国际病毒大会上新设立的 动脉炎病毒科动脉炎病毒属 （ R， 1996） 。按其遗传差异和抗原性差异，可分为欧洲型与美洲型（ A， et 1993）。 在电镜下纯化的 有囊膜 ， 直 径 约 50 65内有 1个呈 20面 体 的 立 体 对 称 的 具 有 电 子 致 密 性的核衣壳 ， 其直径为 25 35外绕一 脂质双层膜 ， 表面有明显的突起。 低温下保存的 潮湿的环境有 助于 而干燥的环境条件则迅速失活。通常在 37下 48h， 50下 45外 ， 或大于 7的情况下 ， 其 感 染 力下 降 90%以上。脂溶剂或去垢剂等处理也可使 该病毒的基因组全长约为 15有 9个开放阅读框架（ 其中 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 基因组成及生物学特性 正 链 其 基 因组 大 小 为 15 含有 9个 开 放 阅 读框架 （ ,其中 位于病毒基因组 5端非编码前导序列之后 ， 占基因组的 80%。 端 ， 14个碱基的非编码区和约 20个碱基的 A） 尾序列。每个 究证实基因组 J， et 1995） 。 生 6个亚基因组 些 编码区的共同前导序列 ， 其长度超过 200个碱基 ， 并且 3末端相同 ， 从而形成了一组共同 3端的嵌套式结构。应用 7与 严若峰等 ， 1999） 。 研究分析表明 ， 种结构蛋白 ， 大小分别为 15、 19、 25、 2930、 31 35和 40 45用 因特异性抗多肽血清和单克隆抗体鉴定证实 ， 它们分别由 囊膜蛋白 ，由 也称 个抗原决定簇 ， 可诱导产生中和抗体 ， 能在体外中和病毒的感染性 ， 病 毒 中 和 作 用 与 抗 有研究表明该蛋白可诱导细胞凋亡。 为非糖基化的膜蛋白 ， 由 具 有很 强 的 免疫 原 性 ， 感染 10天 后 即 可 检 测到 抗 体 应 答 ，因 而 表 达的重组 ， et 1996） 。 由 N 蛋白至少有 5个抗原决定簇 ， 由于该蛋白的保守性较 好 ， 所以其诊断学上具有重要意义。 最近研究证实了这些编码蛋白是病毒结构蛋白 （ ， 1984） ，但其功能和结构还需进一步研究。 抗体依赖性增强作用 （ 是 在猪肺泡巨噬细胞 （ 养物中加入 提高 100倍；病毒中加入 使病毒在胎儿体内的复制 比单独注射病毒显著增强（陈希文 ,2005）。 的亲嗜性 ， 肺泡巨噬细胞 （ 是首选靶细胞 ， 尽管呼吸 道上皮细胞也可被感 染 ， 但巨噬细胞 占肺脏被感染细胞的 80 % 94 %。 通过胎盘进入胎儿体内 ， 特别在妊娠中后期 ， 病毒可通过 胎盘感染胎儿。 仍可 发生持续感染 （ W,1995） 。 遗传变异 基 因 组 序 列 分 析 发 现 欧 洲 型 和 美 洲 型 之 间 的 核 苷 酸 序 列 同 源 性 约 为 55%80%。 株很多 ， 并且各分离株之间存在着广泛的差异， 第一章 绪论 3 是结构蛋 白编码 区中 保守性最 差的两 个基 因。研究 表明欧 洲型 毒株间的 变异 明显小 于 美 洲 型 毒 株 间 的 变 异 ， 美 洲 型 分 离 株 之 间 的 核 苷 酸 序 列 的 同 源 性 达 87%95%。 经过对不同时期仔猪血清内 发现该场 、 B、 C 3个基因亚型 ， 不同基因亚型 差 异 为 11%， 同 一 基 因 亚 型 内 毒 株 基 因 同 源 性 为 98% 99%， 说明 A， et 2001） 。 8株 长基因序列的比对分析，研究表明28株 美洲型 都有变异，并且呈现地域性规律 （ H， et 2006） 。 许多 毒的 5病毒基因组的复制、转录及 翻译密切相关。根据其他相关病毒（如冠状病毒）的分子生物学知识，一些学者认为 或许也存在毒力决定区（ B， et 1999）。欧洲型与美洲型 毒株的 5异很大，同源性仅约 50%。其中欧洲型毒株的 5含221核苷酸，而美洲型毒株的 5列包括 190 或 189 个核苷酸。多数美洲型毒株间的 5列相对保守，仅有个别碱基的置换或缺失，有些弱毒疫苗株的 5其父本毒株（ 比，在 12 个核苷酸起始的引导基元序列前缺失 1 个 U，但 相应位置处亦缺失这一 U，故从现有资料不能说明这一缺失与毒力有关。美洲型毒株的 3非编码区序列比欧洲型毒株的此序列长 22 个核苷酸，同源率为 59%。此外各毒株的 A）的数量 也可能有差异，或许与病毒复制密切相关（ ， et 2000）。 欧、美型毒株的序列比较显示， 列的差异也很大，同源率约为 60%。其中 变异最为明显，是在 9 个 变异最大的一个。各美洲型毒株间的 异虽然比较小，但 变异也相对较大。 各毒株间差异较大的一个编码区，具有种特异性，与 细胞或组织的嗜性有关，在遗传关系很近的毒株间也可有较大差异，故有学者建议可依据此区序列的差异对主要的北美毒株进行分类。鉴于 快速进化给 该病原的控制增加了难度，发展一种依据 因序列来了解 传进化的监测手段将很有意义（ ， et 2000） 。 同型毒株 似性在 88% 99%之间。而欧、美型毒株 2% 55%之间，此差异已相当于它们与异 （ , et 2000）。 普 遍 认 为 ， 含 1段信号肽（翻译后被移走）、 1个外区、 1个三次跨膜区及 1个内区。同型毒株间 列外区近端的高变区内（ 26,且 资 料 显示主 要囊膜 糖蛋 白 的糖基 化位点 数同 毒 株的病 原性有 关。有学者发现 组织 第一章 绪论 4 5蛋白 34位氨基酸由 氨基酸正好位于外区的高变区中（ ， et 1999）。序列比较显示，美洲型毒 株 13位的 51位的 力致弱有关。 13位的突变属保守突变，位于 151位的氨基酸位于糖蛋白的疏水区。 998年报道对 1区分疫苗株和其他北美分离株，这是由于疫苗株 37位的氨基酸为 其他野毒株的第 137位的氨基酸为 D， et 1998）。但随后 种单纯的 限制性内切酶多型性分析（ 法难以区 别朝鲜分离株和来源于美国 S，et 2000），这可能由于 变异在整个基因组中广泛存在，这给 准确检测和有效控制带来很大困难，尝试应用不同的技术手段对 遗传变异规律进行综合分析，对于阐明序列中各元件的具体功能将具有实际意义。 免疫 在体液免疫方面，当猪感染 ，会刺激机体产生一系列相应的特异性抗体。通过间接免疫荧光试验检测发现，在免疫后 6 天时可以检测出 抗 体， 35 42 天 体效价逐渐下降。特异性的 体可以在免疫后 1 周时检测到， 21 28 天时达到高峰， 6 7 周时逐渐下降（ D， et 996） 。血清学中和试验检测发现抗病毒的中和抗体出现较慢，免疫 4 5 周后才能检测到，而且需要高滴度的中和抗体才能清除病毒。虽然抗 抗体水平很高，但 然可以形成病毒血症。研究表明， 体能通过抗原抗体复合物与巨噬细胞 体结合（ M, et 1997），在体内和体外均能增强 巨噬细胞内的复制，即所谓抗体依赖性增强作用（ 同时还观察到疫苗株的抗体可以促进野毒在免疫猪体内的复制；野毒感染产生的抗体也会增强疫苗株在猪体内的复制。免疫母猪的初乳对感染仔猪有保护力，但高浓度的抗体并不能抵抗强毒的攻击，免疫对同源强毒攻击的保护性高于异源强毒攻击的保护性。这表明体液免疫的保护作用是有限的，细胞免疫在 感染中可能发挥更大作用。 细胞免疫方面，在病毒性疾病中，细胞免疫的一个重要作用是清除病毒和预防疾病。为了探讨 何引发细胞介导的免疫反应（ 已建立大量对 原特异性 检测方法，通过 T 细胞反应识别抗原已成为检测抗病毒感染的重要手段，利用该反应已证明 此，目前采用体外 T 细胞增生的方式和体内迟发型变态反应方式来建立检测细胞免疫反应的方法。在体外利用病毒抗原在不同时期刺激 染猪和对照猪的外周血单核细胞来研究 T 细中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 胞的增生反应，并通过检测吸收 3 细胞的增殖量。 染猪后 胞的百分率急剧下降， 胞在第 3、7 和 15 天与对照组差异显著， 胞在第 3 天与对照组差异极显著，但逐步升高，到第 10 天虽然差异不显著但已超过感染前水平（ , et 1997）。大量的资料表明，细胞介导的免疫反应（ 能在 染中起到很重要的作用。据报道， 染后 28 天出现抗原特异性的淋巴细胞增生，在第 49 天到达高峰，第 77 天时出现下降，重复感染后细胞增生反应的幅度加大。这种增生性反应可被抗 类抗原的抗体所阻断，这表明，这种增生性 反应是 T 淋巴细胞依赖性的， 染可产生 胞介导的免疫反应，其感染程度也受 应的影响（ , et 1994）。在自然感染 猪体内可看到淋巴细胞亚群发生了变化，外周血中 胞的比例明显降低，但由于 常与继发感染有密切的关系，而由于毒株的来源及毒力的差异，所以不同报道结果也不尽一致，有的甚至产生相反的结果。 膜 免 疫 系 统 黏膜免疫系统 （ 指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿 生殖道 黏膜 下及一些 分泌腺 处的 淋巴组织 ，是 执 行局 部特异性 免疫功 能的主要场 所。黏 膜免 疫系统是 大量免 疫细 胞和免疫 分子弥 散在 黏膜上皮 内或黏 膜下 固 有 层 ， 或 由 单 个 或 多 个 淋 巴 滤 泡 聚 集 成 的 黏 膜 相 关 淋 巴 组 织（ ， 包 括 肠 道 相 关 淋 巴 组 织 （ ， 支 气 管 相 关 淋 巴 组 织 （ 鼻相关淋巴组织（ 。 机体 50%以上的淋巴组织和 80%以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。黏膜免疫系统的功能包括： 膜免疫系统按功能不同分为两个部位， 即诱导部位 和效应 部位 。前者主 要是黏 膜相 关淋巴组 织 ， 起 捕捉 抗原并提 呈给 、淋巴细 胞的作 用。 后者主要 包括固 有层 ， 上皮内 淋巴细 胞和 一些相关 的外分 泌腺（如泪腺、唾液腺、乳腺等） ， 这里是抗体产生的部位。在诱导部位和效应部位之间 ， 主 要通过 淋巴 细胞归 巢 发生联 系 ， 即在一个 诱导部 位致 敏的免疫 细胞经 胸导管进入血液循环逐渐分化成熟 ， 在特异性归巢受体介导下 ， 约 80%免 疫 细 胞归巢到抗原 致敏部 位（ 即诱导部 位的黏 膜固 有层或上 皮内） 发挥 效应功能 。黏膜 免疫系统和 功能主 要对 黏膜表面 吸入或 食入 大量种类 繁多的 抗原 进行识别 并作出 反应 ， 既可 对大量 无害 抗原下调 免疫反 应或 产生耐受 ， 也可 对有 害抗原或 病原体 产生高效的体液和细胞免疫进行免疫排斥和消除。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 膜 免 疫 系 统 诱 导 部 位 的 免 疫 细 胞 及 功 能 微皱褶细胞（ 于黏膜淋巴组织的滤泡上皮中 ， 是一种特化的上 皮细胞 ， 表 面有不规 则的微 皱褶 ；基底部 向顶部 凹陷 形成一个 中央腔 ，称为 穹隆 ， 穹 隆 内含 有大 量 的 淋巴 细 胞： 胞 、 细胞 和巨噬细胞 , 其中 部和周边细胞质很薄，胞质内含有大量吞 饮小泡 ；基 底部不连 续，便 于淋 巴细胞通 过； 该 处的 溶酶体较 少，使 抗原在转运中不致被降解（ R， 1998） 。 微皱褶细胞专职捕获抗原、运输并 传 递给 黏 膜 免 疫 淋 巴 组 织的 细 胞 。 甚 至 是 肠 腔内 的 一 些 无 活 性 分 子也 能 被 这种 捕获 机制似乎 是不需 要特 异性的结 合。 微 皱褶 细胞 转运 抗原是 引起黏膜免 疫反应的重要的第一步（ N et 1994） 。 这些特点为把疫苗及药 物 传送 到 黏 膜 免 疫 系 统 提供 了 新 思 路 ， 现 在 许多 研 究 就 是 利 用 转 运 细菌和病毒的 特性， 可设 计将其可 转运的 细菌 或病毒减 毒后作 为疫 苗载体。 试验证 明这 是 一种 行 之 有 效 的 办 法 ，脊 髓 灰 质 炎 病 毒 和 沙门 氏 菌 就 具 有 粘 附 并 在黏膜表面生 殖的能 力。 研究发现 将它们 与某 抗原颗粒 相结合 制成 的黏膜疫 苗，可 以增加 罗治彬等， 2000）。虽然 但病