【毕业学位论文】（Word原稿）河南和山西野生大豆耐盐鉴定及耐盐相关基因分析生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 河南和山西野生大豆耐盐鉴定及耐盐 相关基因分析 I 摘 要 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的主要非生物逆境之一。随着人口的增加和耕地的减少，如何 开发利用盐渍化土壤 己成为农业生产和环境生态亟待解决的问题。利用生物技术 深入开展种质资源的耐盐性研究，挖掘其中优异耐盐相关基因，培育耐盐作物新品种，是改良和利用盐渍化土地，增加粮食产量和维持农业可持续发展最为经济有效的策略。 野生大豆（ 栽培大豆（ 原始种，是大豆遗传改良的宝贵资源。本实验旨在通过对 284 份来自河南和山西的野生大豆进行芽期，苗期和全生育期的耐盐性鉴定，筛选高耐盐力的野生大豆种质；利用 析，寻找耐盐相关基因的 用序列分析技术克隆与抗逆相关的基因，并通过原核表达体系和转基因技术进行功能验证。 本研究取得了以下研究进展： 1. 野生大豆芽期、苗期和全生育期耐盐鉴定 对 284 份河南和山西野生大豆进行芽期和苗期耐盐鉴定 。 共鉴定出芽期一级种质 8 份，二级种质 31 份，三级种质 68 份，四级种质 98 份，五级种质 79 份；苗期一级种质 19 份，二级种质20 份，三级种质 26 份，四级种质 80 份，五级种质 127 份。在田间耐盐鉴定中筛选出五份耐盐力较好的材料，分别是 2. 野生大豆耐盐相关基因的 析 根据在 找到的 8 个大豆耐盐 相关基因的 列，分段设计引物， 物片段为 150300过对耐盐鉴定芽期和苗期均为中级的野生大豆群体内单株的 因在野生大豆群体 存在单碱基变化位点，将 体分为两组。 3. 野生大豆 因的克隆 通过测定所克隆到的 全基因序列，发现此基因片段大小与 的 过序列比对，在带型 2 中发现了 7 个变化的核苷酸位点，其中有 5 个位点为同义突变，只有位于 248 位和 536 位的变化位点 影响到氨基酸编码顺序。 4. 野生大豆 因的功能分析 将克隆到的 因片段构建到原核表达载体 ，在 导下表达融合蛋白， 并对表达产物进行 析 。 结果发现 诱导出了一条新带，并且 h 时表达量最大，具有较好的表达活性。同时 将克隆到的 因片段构建到真核表达载体 ，在农杆菌的介导下转入拟南芥中，根据 性筛选出转基因植株。 关键词： 野生大豆， 盐相关基因，转录因子， is of of s of to to to G. is G. G. is . . 284 at of of to of A. 1. of at of of in 84 at of of At of 8 , 31 , 68 , 98 9 . at of 19 , 20 , 26 , 80 27 . on 2. of to in to of CR is 50bp 00of is in be to of 3. in he of it is to is no in 7 in . 5 248 36) . in of A 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文全称 核苷酸多态性 链构象多态性 六烷基三乙基溴化氨 脱落酸 霉素磷酸转移酶 移 福平 苄氰霉素 bp 基对 血清白蛋白 甲基亚砜 硫苏糖醇 化乙锭 二胺四乙酸 哚乙酸 胎发生晚期蛋白 发阅读框 丙烯凝胶电泳 合酶链式反应 SA 杨酸 二脘基磺酸钠 羟甲基氨基甲烷 43 V 目 录 第一章 绪 论 . 1 献综述 . 2 内外植物耐盐机制的研究进展 . 2 盐胁迫对植物的危害 . 2 植物耐盐机理 . 2 国内外植物耐盐相关基因的研究进展 . 3 植物在盐胁迫下诱导表达的基因及其产物 . 3 植物对盐胁迫应答的信号传导途径 . 5 胁迫诱导基因的调控与表达 . 7 植物耐盐基 因工程研究 . 8 豆耐盐相关基因研究进展 . 9 豆在我国农业生产中的地位 . 9 国野 生大豆资源 . 10 生大豆在栽培大豆遗传改良中的作用 . 11 豆分子标记研究现状 . 11 豆耐盐相关基因 . 13 究目的和实验设计 . 14 究目的和意义 . 14 究内容 . 14 术路线 . 15 第二章 河南和山西野生大豆资源耐盐性鉴定评价 . 16 言 . 16 料和方法 . 17 料 . 17 法 . 17 期耐盐性鉴定方法 . 17 期耐盐性鉴定方法 . 17 株耐盐性鉴定方法 . 18 生育期耐盐性鉴定 . 18 计分析 . 19 果与分析 . 19 期耐盐性鉴定结果 . 19 期耐盐性鉴定结果 . 19 株耐盐性鉴定结果 . 22 间鉴定结果 . 23 论 . 25 第三章 野生大豆耐盐相关基因 析 . 26 言 . 26 料与方法 . 27 料 . 27 法 . 27 豆基因组 取 . 27 盐相关基因分段引物设计 . 28 . 28 异片段测序 . 29 点分析 . 29 果与分析 . 30 物筛选结果 . 30 异片段的筛选 . 30 列测定结果 . 31 论 . 32 第四章 野生大豆 因的克隆 . 33 言 . 33 料和方 法 . 34 料 . 34 法 . 34 因组全长的获得 . 34 物回收 . 34 隆技术 . 35 列测定 . 36 物信息学分析 . 36 果分析 . 36 长基因的获得 . 36 组体构建及筛选 . 37 长基因分析 . 37 长基因核苷酸序列分析 . 37 长基因氨基酸序列分析 . 40 论 . 41 第五章 野生大豆 因的功能分析 . 42 言 . 42 料与方法 . 43 料 . 43 方法 . 43 生大豆 因在 的表达 . 43 的片段的获得 . 43 核表达载体的构建 . 44 导融合蛋白的表达及检测 . 46 生大豆 因在拟南芥中的表达与功能验证 . 48 的片段的获得 . 48 核表达载体的构建 . 48 化拟南芥植株 . 51 基因拟南芥的筛选 . 52 果分析 . 52 生大豆 的表达 . 52 核表达载体的构建 . 52 化表达菌 . 54 合蛋白的诱导表达 . 54 生大豆 拟南芥中的表达 . 55 核表达载体的构建 . 55 杆菌转化 . 57 基因拟南芥植株的获得 . 58 论 . 58 第六章 结 论 . 60 参考文献 . 62 附录 . 67 附录一 河南野生大豆资源目录 . 67 附录二 山西野生大豆资源目录 . 68 附录三 河南野生大豆芽期和苗期耐盐性鉴定结果 . 69 附录四 山西野生大豆芽期和苗期耐盐性鉴定结果 . 71 附录五 河南和山西 野生大豆全生育期鉴定结果 . 72 附录六 物列表 . 78 附录七 部分试剂配方 . 79 致谢 . 83 作者简介 . 84 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的主要非生物逆境之一。据联合国粮农组织 2000 年统计，全世界共有盐渍化土地面积约 4 亿多公顷，仅我国就有 7000 多万公顷（不包括次生盐渍化土壤面积）（ 2000），分布在西北、华北等粮食主产区，对于农业生产构成了严重威胁。由于 工业污染 、不合理的 灌溉 以及 化肥使用 不当等 人 为因素的影响，次生盐渍化土壤的面积 仍 以每年 3% 的速度递增 ； 同时，随着国民经济的发展、城市面积的扩大和人口的不断增长，农用耕地不断被蚕食。因此 ， 开发利用盐渍化土壤， 提高土地 利用率 是农业生产和环境生态亟待解决的问题。 在二十世纪八十年代初期， 1980）等提出盐渍化土壤开发利用的二种途径：一是环境适应作物，即用传统水土工程改良盐碱地；二是培育适应逆境的品种。实践证明，第一条途径人力、物力、财力消耗巨大，成本昂贵，并耗费大量淡水资源，目前淡水资源匮乏，因而受到极大限制。因此，选育耐 盐品种是缓解土壤盐渍化、次生盐渍化对农业生产影响的最经济有效的方法（翁跃进， 2002）。 选育优良的耐盐品种要依赖耐盐基因的多样性，而丰富的耐盐基因资源存在于多种多样的品种（包括古今中外的品种）及其野生近缘植物当中，这些被称作是作物种质资源的品种及其野生亲缘植物是耐盐基因多样性的主要组成部分。农业起源和发展的历史表明，作物种质资源及其多样性，不仅为人类的衣、食等方面提供原料，为人类的健康提供营养品和药物，而且为人类的生存提供了良好的环境，尤为重要的是，它还为人们选育所需求的优良品种，开展生物技术研究提供取之不 尽，用之不竭的基因资源。作物种质资源的多样性越丰富，改良栽培品种或选育新品种的潜力就越大。因此多方面挖掘和收集耐盐种质资源，并利用生物技术深入开展种质资源耐盐性研究，进而挖掘其中优异的耐盐相关基因，培育耐盐作物新品种，是改良和利用盐渍化土地，增加粮食产量和维持农业可持续发展的中心策略。 随着植物生理学和分子生物学的相互渗透及其技术的蓬勃发展， 人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的耐 （ 抗 ) 性机理。经过大量研究 ， 现今人们已在植物抗逆的形态学、生理生化、生物物理、生态以及细胞遗传 学方面取得了广泛进展 ， 并已克隆分离了一些盐胁迫诱导表达的基因。 基因组学 （ 兴起与发展把当今的生物学研究推向了一个新纪元，它是研究方法的革命与飞跃。 利用基因组学的方法不但可以挖掘大量的耐（抗）性基因 ， 对其功能进行详细的研究 ， 而且还有助于全面理解植物的抗逆机理 ， 为利用遗传工程提高植物抗性奠定了基础。采用重组 已发展成为改良植物耐 （ 抗 ) 胁迫性的新途径。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 献综述 内外 植物耐盐机制的研究进展 盐胁迫对植物的危害 盐胁迫是限制植物生长的重要因素之一，据报道盐渍化的影响涉及到 40%的灌溉土地，对农作物的减产应负 70%的责任（ et 1982）。植物遭受盐害时表现黄萎、叶片变小、生长受到抑制，盐害较严重时，会造成农作物大面积减产，甚至颗粒无收。 盐胁迫对作物的伤害机制有两种 ： 一是离子伤害。盐胁迫下 ， 作物被迫吸收盐离子，由于盐离子的毒害作用，造成活性氧等自由基产生和修复系统的动态平衡被破坏，启动了膜脂过氧化作用或膜蛋白过氧化作用，造成膜脂或膜蛋白损伤，从而破坏膜结构，使质膜 的透性增加，胞内水溶性物质外渗，作物表现出盐害特征。二是渗透胁迫，土壤中的盐分使土壤溶液的水势降低，作物吸水困难造成“生理干旱”，从而表现出盐害症状（赵可夫， 1999）。 植物耐盐机理 为了适