[精品]饲用酶制剂理化特性及评定74

饲用酶制剂理化特性及评定,武汉新华扬生物有限公司,詹志春,饲用酶制剂基本理化特性,酶制剂应用效果评定,稳 定 性,底物针对性,Sunhy,1、稳定性,酶制剂稳定性问题 是影响酶制剂使用效果的重要因素,热稳定性和储存稳定性,对饲料中抑制剂的敏感性,Sunhy,对动物消化道内环境的抵抗力,热稳定性和储存稳定性,优质的饲用酶制剂必须具有良好的热稳定性和储存稳定性，以避免在饲料加工和储存过程中失活。,Sunhy,也是酶制剂产品研发过程中重点考虑的问题,酶制剂稳定性的评定,体外评定温湿度、酸碱度和储存时间等对酶活性的影响,Sunhy,制备的待测酶液（已测定酶活）,设定一定梯度的温湿条件（模拟饲料加工参数）,设定一定的温度、湿度和时间梯度（模拟饲料储存条件）,测定酶活,测定酶经过不同条件处理后酶活的存留率,体外法,测定酶在湿热条件下的稳定性,Sunhy,典型例子,酶样品,提 取 并 测 定 其 酶 活,计算酶活存留率,酶活测定,测定酶在储存条件下的稳定性,Sunhy,典型例子,酶样品,测 定 其 酶 活,计算酶活存留率,酶活测定,HY-Nutrex细菌性木聚糖酶耐热性测试,Sunhy,实验测试,Nutrex,Fungl Enz,真菌R,Powder对照,65制粒,75制粒,85制粒,HY-Nutrex细菌性木聚糖酶储存稳定性,Sunhy,实验测试,对抑制剂敏感性,饲料植物原料中存在着酶制剂的抑制剂（一些原料中存在的糖蛋白类物质，甚至常规的一些金属元素），在饲料中使用酶制剂的效果将受到这些抑制剂的影响，故选用对抑制剂敏感度低的酶在实际应用中也非常意义的。,Sunhy,体外分析酶对抑制剂的敏感性,Sunhy,酶样品,提 取 并 测 定 其 酶 活,计算酶活存留率,反 应 器,不同浓度的抑制剂,酶最适反应条件,典型例子,酶活测定,结论：细菌性酶对抑制剂敏感度低,抑制剂,软粒小麦木聚糖酶抑制剂 (TAXI) 水溶性，非热稳定蛋白质,细菌性木聚糖酶对抑制剂的低敏感性,资料来源 : Debyser, 1999,Sunhy,实验测试,对动物消化道内环境的抵抗力,Sunhy,体外法,一般是模拟单位动物胃环境来分析酶对动物消化道内环境的抵抗力,动物消化道环境参数的确定,反应器的制作,Sunhy,37.0 、pH值2.0，一定浓度的胃蛋白酶，30min-4h,测定酶活,典型例子,以模拟猪胃环境为例,振荡,酶活测定,体内法,是将酶制剂添加到动物饲粮中喂动物，在采食一定时间后进行动物屠宰，取消化道各段食糜，测定酶活。,Sunhy,取样时间的确定,食糜中酶活的测定,Sunhy,胃,十二指肠,小肠,大肠,排泄物,加酶饲料,屠宰，取食糜，沉淀、离心,酶活分析,HY-Nutrex细菌木聚糖酶 最适pH活性范畴：偏中性,Sunhy,HY-Nutrex细菌木聚糖酶 在动物体内酶的活性/作用,Sunhy,实验测试,2、底物针对性,酶是一种底物专一性的生物催化剂，因此对特定的底物，必须选用特定的酶制剂才能发挥催化作用。,Sunhy,广义的底物专一性,大麦葡聚糖酶小麦木聚糖酶,典型例子：,针对不同的饲料原料（如玉米、小麦和大麦等）选择不同的酶制剂,Sunhy,小麦,玉米,狭义的底物专一性,针对饲料原料中不同的底物化学构成选择酶解特性不同的酶制剂,典型例子：,小麦内切木聚糖酶玉米内切木聚糖酶杂粕内切木聚糖酶,对酶的选择更加精细、有效,Sunhy,饲用酶制剂底物针对性的评定,体外法,是在体外模拟酶制剂作用的适宜条件或动物消化道内环境条件，将酶制剂按一定剂量加入待测原料中通过测定底物降解量或产物生成量或粘性下降程度来反映酶制剂作用效果的方法。,Sunhy,体外消化模拟方法,Sunhy,单酶法,测定pH法,pH变化幅度法,pH恒定法,测定养分消化率法,多酶法,两步法,胃蛋白酶胰酶法,胃蛋白酶猪小肠液法,去除消化产物法（透析）,不去除消化产物法（离心，沉淀和过滤）,三步法,胃蛋白酶胰酶瘤胃液法,胃蛋白酶胰酶碳水化合物分解酶法,其他（肠道食糜）,Sunhy,典型例子,胃蛋白酶胰酶去除消化产物法,加酶原料,胃蛋白酶,30min,2小时,过滤，沉淀干燥,胰蛋白酶,测定和分析重量和组成,比较分析酶效应,体外模拟动物消化道环境是非常有难度的，因为动物消化道内环境是一个动态变化的复杂环境，它受到很多因素（包括动物种类、动物生理阶段、动物机体状态、日粮类型等）的影响。,Sunhy,不能反映体内的真实情况。体外试验与体内试验不能完全吻合，但具有一定的参考价值,小麦样品的制备,酶液的制备,粘度测定,匀浆,酶最适反应条件,Sunhy,粘度测定,典型例子,粘度试验,HY-Nutrex酶对小麦粘度的作用,Sunhy,饲用酶制剂应用效果的评定,Sunhy,饲用酶制剂理化特性的评定,性质,功能,理论,应用,Sunhy,代谢试验,进行代谢试验，采用强饲法评价酶对动物养分利用率和日粮表观代谢能的影响,动物生产性能试验,通过科学的试验设计，在动物日粮中添加酶制剂，统计分析动物的生产性能来反映酶制剂的作用,Sunhy,动物生产性能试验是评价酶制剂优劣的最直接、最具说服力的方法,但，实际生产过程中，影响动物生产性能的因素很多，不同动物，不同生理阶段，不同日粮组成都会对酶制剂应用效果产生很大的影响；此外，不确定的生产管理方面的因素也会影响应用效果。,Sunhy,关于体外酶活测定,酶的含量不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示：酶活,Sunhy,酶活的定义,Sunhy,测定酶活的因子:pH值,温度,底物浓度及类型,时间,产物数量表述方式,表述:时间:s;min;hr;30min底物浓度:1g/100ml;2g/100ml;3g/100ml;4g/100ml终产物:mg;ug;ng;mmol;umol;nmol,酶活(u/g)=,产物量及类似物,加酶量时间,酶活性的测定，可以用测定特定底物（天然提取或人工合成）的消失率，或测定酶催化的生化反应的产物的生成量来衡量也可以用合成底物来测定酶的活性,酶活性的测定方法,Sunhy,还原糖法,粘度法,底物染色法,不同的测定条件（温度、pH、底物及底物的浓度等）会得到不同的测定结果。,在目前条件下，采用体外酶活测定的方法评定酶制剂的优劣具有很大的局限性，不具有实际应用意义,Sunhy,温度对酶活性的影响,测定温度一般为3055 C，动物体内的温度在40 C左右,温度对两种葡聚糖酶活性的影响(pH 5, 1.0% 底物),温度,酶活性 (U/g),Sunhy,两种葡聚糖酶的活性在30 C下测定时很接近，但在40 C下，其差异变大，随着温度的升高，差异会更大,pH值对酶活性的影响,pH对两种葡聚糖酶活性的影响 (30oC, 1.0% 底物),酶活,典型木聚糖酶及葡聚糖酶活性测定的pH为4.85.5;消化道内pH: 胃为22.5，小肠为6.07.0,在pH为5时，两种葡聚糖酶的活性相近，但高于5或小于5时，其差异非常大，只展示在pH为5时的测定结果是不够的,Sunhy,底物类型对酶活性的影响,不同底物对三种木聚糖酶活性的影响,Sunhy,从逻辑上讲，如果动物饲喂的基础日粮以小麦或玉米为主，测定木聚糖酶的活性应该分别用小麦或玉米木聚糖为底物,底物浓度对酶活性的影响,底物浓度对两种木聚糖酶活性的影响 (pH 5, 50oC),底 物 浓 度 (毫克/毫升),酶活性 (U/g),动物消化道内底物的浓度一般为12毫克/毫升,Sunhy,不同提取液对各类植酸酶提取效果,Sunhy,提取液:Tritonx-100牛血清白蛋白,钼兰法,醋酸钠,pH=5.0提取液: Tritonx-100,钼黄法,醋酸钠,pH=5.0提取液: Tween-20,钼黄法,醋酸钠,pH=5.5 提取液:a.c.s,钼黄法提取液:CaCl2,钼黄法,醋酸钠,pH=5.0,体外测定酶活的条件与酶在动物体内发生作用的条件有天壤之别（温度、PH、底物组成结构、底物浓度、底物存在形式）,不同微生物产生的酶的特性存在很大差异,Sunhy,现用的DNS检测法（真菌木聚糖）尚不能评估出细菌性木聚糖酶的酶活及生物学（饲用）效果,典型例子：,Sunhy,DNS还原糖方法原理：木聚糖酶在一定条件下，水解木聚糖生成木糖等还原糖，每次水解都从新的还原糖末端开始。生成的木糖等还原糖进行DNS显色反应,Sunhy,内切木聚糖酶作用模型,阿拉伯木聚糖 A A A A A A A A X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X,X : 糖单元 X : 还原糖单元 A : 阿拉伯糖,Sunhy,内切木聚糖酶的测定,经染色并绞连的小麦阿拉伯木聚糖 (特点:高度纯化,不可溶于水),其中药片(底物):Xylazyme Ax Tablets由爱尔兰Megazyme公司提供,Megazyme法(