安徽医科大学研究生细胞培养技术考试重点.doc

学习资料收集于网络，仅供参考名词解释：1.群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。是由于表示群体细胞指数生长期内细胞分裂活动的程度，是判断细胞生长是否旺盛的重要指标。2.接触抑制（contactinhibition）：细胞相互接触后失去运动的现象。3.密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多和生存空间消失所引起的细胞增殖的抑制现象。4.肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSC)表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能。TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。5.细胞汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。6.饱和密度(Saturation density)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。7.二倍体细胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。8.二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。9.组织工程：是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。10.细胞融合(Cell fusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。11.细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。12.三维培养：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。13.平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）：简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。 兼具缓冲和调节溶液的酸碱度、维持渗透压、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用 。14.生长基质（growth substratum）：培养器皿表面包被的一层能改善生长表面的特性，促进细胞粘附和贴壁的物质。15.去分化（dedifferentiation）：指已成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。16.消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。17.消毒 disinfection 杀死物体上病原微生物的方法。灭菌 sterilization 杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。18.转化细胞系：指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定的表型改变的细胞系。19.杂交瘤技术：又称单克隆抗体制备技术，是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。20. 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。21.干细胞：是指具有无限或较长期的自我更新能力、多种分化潜能和高度增殖能力的细胞。22.全能干细胞，如ES细胞。全能干细胞可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织和器官。23. 成体干细胞：在胎儿、儿童和成人组织中存在的具有自我更新、多向分化潜能和增殖特性的多能干细胞，统称为“成体干细胞”。24.融合剂：两个或两个以上的细胞融合过程中，能促使细胞融合并使细胞融合的频率显著增大的物质，如仙台病毒，PEG等。25.克隆化：专指一般DNA在与载体DNA分子重组后，重组DNA分子由载体导入宿主细胞内，依赖载体的复制能力在宿主细胞中进行扩增，形成一个无性繁殖系的过程。26.细菌污染：包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞。培养的细胞被细菌污染均会造成细胞受损和死亡，是细胞培养工作的大敌。 细胞发生污染时，常有培养液变浑浊和PH发生改变等现象，镜下观察细胞变形、生长缓慢或分裂相消失，以及细胞圆缩脱落等现象。常有抗生素预防该污染。27. iPS：诱导多功能干细胞即诱导多能干细胞，是指体细胞经过基因“重新编排”，回归到胚胎细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力。这种方法可以不需要用人胚胎或卵母细胞，就能制造干细胞。28. 克隆：指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。简答题：1.简述细胞培养污染的种类及污染的预防措施 种类：（1）物理污染：温度、放射线、震动、辐射等；（2）化学污染：水、血清、容器、孵箱等的有毒物质的残留；（3）生物污染（支原体污染）：外界的动物、微生物如霉菌、细菌、支原体和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染。预防措施：（1）良好的规章制度：只有相关人员才可进入细胞培养区，细胞培养区必须和其他区域分开，细胞培养区应布局合理；（2）良好的无菌操作：所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌，吸入或吸出液体时避免倾倒，不要触碰细胞培养瓶的瓶口，清洁区和污染区的材料应单独处理；（3）保持工作区清洁：常规清洗地面和台面，定期清洁水浴箱、CO2孵箱、生物安全柜等，及时清理废弃物；（4）合理利用抗生素（5）建立细胞库：消除了隐蔽污染的潜在危害（6）细胞污染的检测2.试述细胞培养的基本概念、原理、优缺点及实际意义1）概念：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。2) 原理及优缺点：细胞培养是将确定所选组织用剪碎的小组织块或分离的单个细胞进行培养，这种培养失去了原有组织类型及某些生化特征，但它们可以增殖，特性化，获得遗传背景相同的群体，可以保存。3）实际意义：组织（细胞）培养对医学、生命科学的意义培养的组织器官或细胞，能再一定范围和程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物质基础。如药物筛选，疗剂评价，新生物制品研发，研究病毒及其他微生物，发现新的传染因子，组织工程中的支撑技术等。细胞培养技术已经成为商品化生物技术产品的核心。如目前可提供的产品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等；非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素和集落刺激因子等；多肽生长因子：表皮生长因子和神经生长因子等；酶类：组织型纤溶酶原激活剂；激素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤生产的各种单克隆抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。4）组织（细胞）培养的局限性：细胞（组织）培养，包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估都必须考虑这些。3.简述细胞培养过程中如何进行微生物污染防治1）把好每一个关口，尽可能禁止任何有污染的物品进入培养操作环节；2）抗生素：一般用常用量的510倍作冲击疗法。用药2448h后， 再换常规培养液。3）加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细 胞放置在41作用510h，最长不超过18h后，以杀灭支原体。4）动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。 4.试述目前体外细胞培养中广泛使用最多的天然培养基类型及其作用天然培养基（液）的种类很多，包括生物性体液（如血清、血浆）、组织浸液（胚胎浸液）、水解乳蛋白等。1）血清：血清中含有基本的营养物质血清中含有激素与生长调节因子血清中含有促进细胞粘附和铺展的因子 血清中含有结合蛋白 血清中含有抗机械损害的非特异性保护物质 血清中含有pH缓冲物质 血清中含有蛋白酶抑制剂2）胚胎浸出液（embryonic extract）是早期动物细胞培养中应用的天然培养基，如鸡胚浸出液、牛胚浸出液等。胚胎浸出液主要成分为大分子蛋白和小分子氨基酸，有促进细胞生长的作用。3）水解乳蛋白（lactalbumin hydrolysate）为乳白蛋白经蛋白酶水解的产物，含有富 的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。5.血清的优缺点：1）优点：血清中含有基本的营养物质血清中含有激素与生长调节因子血清中含有促进细胞粘附和铺展的因子 血清中含有结合蛋白 血清中含有抗机械损害的非特异性保护物质 血清中含有pH缓冲物质 血清中含有蛋白酶抑制剂 2）缺点： 血清中也存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质 血清的成分不明确，影响对结果的分析 对多数动物细胞来讲，血清并不是细胞在体时直接接触的生理性液体，只有在伤口愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种 细胞在体内的正常状态。 血清也具有潜在的细胞毒作用，除了特异性抑制成分、细菌毒素以及脂类成分之外，还含有多胺氧化酶等。 不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。需要分批筛选，而且永远不可能保持批次间的一致； 在培养液中使用血清会增加成本，尤其是对于动物细 胞的大规模培养以及使用胎牛血清培养的情况更如此； 血清中有时所含的生长因子水平不足而需要补充，若补充过量会抑制细胞生长。培养批次与血清批次不同，生长因子水平是难以控制的。6.简述体外培养细胞的主要生物学特点 去分化；贴壁铺陈；接触抑制；密度依赖性生长抑制7.体外培养用液的种类及用途 主要包括：培养液（维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。）、缓冲液（中和培养液中的酸性物质）、平衡盐溶液（配抗生素、消化液、洗涤细胞等）、消化液（分离细胞）、血清、pH调整液和抗生素等其它常用液。8.比较天然和合成培养基的优缺点1）天然培养基：最初的体外细胞培养，均采用天然培养基。其主要取自动物体液或从动物组织中分离提取。 优点：营养丰富，培养效果良好； 缺点：成分复杂，来源受限，影响对某些实验产物的提取和结果的分析，易发生支原体染。2）合成培养基：细胞在体内生存生长所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。优点：标准化生产，组分和含量相对固定成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。9.试述细胞体外培养的条件体外培养细胞的基本要求主要包括细胞接种、培养液成分、酸碱度、气体条件、温度、水的纯度及无菌条件。1）细胞接种：接种细胞密度10-4-10-5。选择对数期的细胞接种。2）营养物质：天然培养基：营养成分复杂，包括血清、组织浸出液、淋巴液、水解乳蛋白等； 合成培养基：包括水、无机盐、葡萄糖、维生素、氨基酸等；3）酸碱度：细胞能耐受的pH范围是6.6-7.8，最是的pH为7.2-7.4，要依靠缓冲系统调节，主要是CO2-NaHCO3 系统。 4)气体：细胞生长需要，主要用于调节细胞培养的pH，同时也用于合成细胞物质。 5）温度：最适宜生长的温度为3537； 6）水：一般使用的是去离子水或三蒸水，适宜细胞培养； 7）抗生素：加入两性霉素可控制微生物的生长。10.体外培养肿瘤细胞的三个显著特征：永生性、不受控增殖性、致瘤性。（转化细胞系的特征） 1）永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞系（株）都表现有这种性状。 2）细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度的指标。3）失去接触抑制，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。失去锚着依赖性（停泊依赖性），可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。 癌细胞或培养中发生恶性转化后的单细胞培养时，形成集落的能力比正常细胞强。11.简述原代肿瘤细胞制备过程及其注意事项及如何建成永久性细胞系 癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标本收集和处理、原代培养、传代、换液、冻存、复苏等过程。 1）取材：取材部位非常重要，要挑选活力较好的部位，一般是癌组织最外层最活跃细胞。注意去除标本中混杂的间质组织。 2）分离：机械方法、酶消化法，其中酶消化法是分散癌细胞的好方法。 3）接种细胞：消化后制备的癌细胞，培养时应有足够的细胞密度，通常接种细胞浓度为5105ml，37培养。 4）成纤维细胞过度生长的去除：常采用机械刮除法、反复贴壁法等。 5）选择性培养基：选择性培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细胞生长的关键技术改进。 6）饲养层：在培养器皿底部接种能形成接触性抑制的成纤维细胞饲养层，可以有利于癌细胞生长和抑制癌组织中正常成纤维细胞过度生长。7）及时换液 癌细胞系建立注意事项：取材应选择活力较好的部位，尽快培养且要防止污染。及时去除生长的成纤维细胞。掌握好传代时间，细胞没有长到足够量时不要急于传代。早期应先以高浓度接种，再逐渐降低。对于增殖能力低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些促生长物质。精心传代、换液、避免污染，需经半年以上的细胞培养，方能够达到建立细胞系的目的。如何建成永久性细胞系：建立癌细胞系需要在体外进行长期培养和传代，传代50次以上才能被认为是永久性细胞系。建系过程需要不断冻存以防细胞系中断。12.杂交瘤技术产生的三个技术基础（关键）：1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞：B淋巴细胞（B lymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞。骨髓瘤细胞 (myeloma cells)：恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。没有抗体分泌。 经筛选HGPRT或TK。 2）细胞融合技术：分泌抗体短命脾细胞(B淋巴细胞)、长命不分泌抗体骨髓瘤细胞、分泌抗体长命杂交瘤细胞。3）杂交瘤细胞的筛选：用HAT选择培养基进行筛选，只有杂交瘤细胞被筛选出。13.试述杂交瘤技术制备单克隆抗体三个基本环节和两个决定因素 三个基本环节 1）浆细胞瘤细胞系，骨髓瘤细胞NS1或SP2/0，需通过8-氮鸟嘌呤选择出来，有利于HAT选择培养基筛选。而且NS1或SP2/0必须是对数生长期，细胞密度控制在105ml，细胞活力达95%，进行细胞融合时1.5*108细胞数。 2）免疫鼠脾细胞良好、合适，大多数情况下，并不需要高度免疫； 3）融合剂良好合适，50%PEG。 两个决定因素 1）选择培养基（HAT） 2）饲养细胞（104ml以上）：来自同系小鼠的胸腺细胞或腹腔巨噬细胞14.与胚胎干细胞相比较，成体干细胞有以下几个特点：(1)成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。(2)成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。(3)成体干细胞常处于一个有干细胞细胞基质、对干细胞的增殖和分化起调控作用的各种信号分子的特定微环境或称生物位中，干细胞是自我复制还是分化为功能细胞，取决于所在的微环境和自身的功能状态。(4)成体干细胞没有确定的来源。15.干细胞研究的意义 干细胞在生命科学的各个领域都有着重要而深远的影响，如移植治疗、克隆动物及转基因动物的生产、细胞组织和器官的修复、组织工程等有着广阔的应用前景。 1）移植治疗：移植治疗目前已成为治疗疾病的一个重要手段，如器官移植、细胞移植等。 2）克隆动物及转基因动物的生产：利用这项技术人们还可以将一些在发育过程中非必需的基因敲除（knock out），在体内进行功能缺失研究；还可以通过基因功能获得性突变，使特定基因在发育的某一时期表达，从而研究该基因在胚胎不同发育时期中的作用。 3）转基因干细胞基因治疗：现有的基因治疗有两类：转基因细胞治疗核酸治疗。 4）为发育生物学研究提供理想的体外模型：胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究个体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。5）高效新型药物的发现、筛选及动物和人类疾病的模型：胚胎干细胞提供了新药物的药理药效、毒理及药物代谢等研究的细胞水平的研究手段。利用胚胎干细胞体外分化的细胞组织检验筛选新药，可大大减少药物实验所需实验动物的数量及其人群数量。总之，干细胞研究对细胞组织移植治疗，体外研究动物、人胚胎的发生、发展，新的人类因发现，药物的筛选和致畸实验及克隆动物、转基因动物等领域将产生重要的影响。16.试述进行成体干细胞研究有哪些优势 1）成体干细胞则可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。此外，少量的骨髓切除治疗有助于形成部分造血嵌合体，可使异体成体干细胞的治疗成为可能。2）成体干细胞不会引发畸胎瘤。3）成体干细胞也具有类胚胎干细胞的高度分化能力。 在人体发育的过程中，可能成体干细胞是存留在多种组织中具有多系分化能力的亚全能干细胞群体，这些细胞都具有相同或相似的细胞表型，在适合的微环境下可分化成多种组织细胞。17.试述癌细胞系鉴定要点（简述体外培养肿瘤细胞生物学检测的常规项目）培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后，需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于：证明所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。1）形态观察：主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。 2）细胞生长增殖：检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。 3）细胞核型分析：检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。 4）软琼脂培养：检测集落形成能力。5）异体动物接种：向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液，观察成瘤能力。 6）其它：根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。18.简述细胞系的生长过程及各期细胞的特点1）原代培养期：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。组织到第一次传代时间大约为14周。特点： 培养细胞成分混杂，呈现异质性。 细胞活跃移动,分裂,但不旺盛,多呈二倍体核型。 原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等。 为保持二倍体体细胞性质，应在初代或传代后早期冰冻。2）传代培养期：首次传代开始经反复传代一直到培养细胞开始衰退之前的全部时间。初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)。特点：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid cell line) 一般细胞在10代以内冻存。 细胞逐渐进入去分化状态。原本成分混杂的培养物中,某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势,比例越来越大,而将其它数量较少比例较小的细胞逐渐淘汰掉。3）衰退期： 细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 轮廓增强，色泽变暗，胞质出现颗粒样及空泡状结构。在细胞生命期阶段，少数情况下，在不明原因的影响，细胞可能发生自发转化。标志之一，是细胞获得不死性即持久性增殖能力，这样的细胞群体称“无限细胞系”。核型大多变成异倍体，接触抑制消失。19.干细胞研究的主要内容与问题 1. 主要内容 1）干细胞的分离与鉴定 2）干细胞的自我更新 3）干细胞的定向分化 4）干细胞的临床应用 2. 问题1)胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞的分 子机制；2)成体干细胞横向分化的条件；3)各种组织的成体干细胞库的建立及临床治疗试验；4)细胞移植的免疫排斥问题。20. 粘附生长型细胞根据形态分为几种类型，试述各型主要特点。1）粘附型细胞（Monolayer cells）:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 a 成纤维细胞型：形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则，三角形，胞质向外伸出23个长短不等的片状伪足，中有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。b上皮细胞型：形态：类似体内的上皮细胞，扁平、不规则多角形，中有圆形核。生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺路石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。c 游走型细胞：培养需要支持物，分散生长，不连接成片，在培养皿中生长位置不定，处于活跃的游走或变形运动，因此外形不规则且不断变化, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。 d 多型性细胞：无规律的形态，细胞分胞体和胞突。胞突细长形，似丝状伪足，胞体略呈多角形。21.试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。1）克隆：指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。2）实际意义： a 检验医学诊断试剂：单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。目前，单克隆抗体商品化试剂盒广泛应用于： 病原微生物抗原、抗体的检测； 肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；激素测定；细胞因子的测定。b蛋白质的提纯：单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。2.试述原代细胞培养的基本概念、原理、优缺点及实际意义。1）概念：一般指细胞从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养