菌株鉴定流程总结.doc

菌株鉴定流程总结 学习总结各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。 现将我在实验室学习的情况总结汇报。 一、细菌鉴定流程1.表观观察鉴定1.1培养24h的菌落观察，如菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。 1.2显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。 1.3染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。 2.分子鉴定2.1细菌DNA的提取（试剂盒法）将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。 将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。 向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。 如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37，30min以上。 向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。 加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 重复操作步骤。 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE（或ddhH2O），室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20保存。 2.2PCR扩增和电泳检测细菌扩增引物（16SRrDNA）为27F5-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3；1492R5-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3。 扩增体系10x buffer5l dNTP4l Mg2+3l引物11l引物21l Taq酶0.4l模板2l双蒸水33.6l总体积50l PCR的扩增条件Lid temp99预变性温度955min变性温度941min退火温度5830s延伸温度7290s最后延伸7210min保温4电泳凝胶检测基因组的在2.3kb处，扩增引物在1.5kb处，如在23kb和1.5kb处出现亮条带，则操作成功。 35个循环2.3送去测序（华大基因测序和博尚生物测序）2.4DNA分子拼接，由测序公司拼接或者自己用DNAMAN拼接2.5在NCBI上进行核苷酸序列比对以及用MEGA软件构建系统发育树。 3.生理生化鉴定根据分子鉴定的结果（已鉴定到属），对照常见细菌鉴定手册进行生理生化的鉴定。 常规生理生化的鉴定3.1糖醇类发酵，产酸产气一般细菌以休和利夫森二氏培养基，芽孢菌用芽孢菌专用培养基或用休和利夫森二氏培养基进行培养观察。 葡萄糖以被测1%糖、醇代替。 主要包括D-葡萄糖、乳糖、半乳糖（麦芽糖替代）、蔗糖、D-甘露醇、肌醇、D-山梨醇、D-木糖、D-果糖、甘油。 以幼龄斜面培养物穿刺接种于上述培养基，适温培养，1，3，5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性;不变或变蓝则为阴性。 3.2甲基红、V.P测定甲基红（M.R）和V.P测定的实验使用相同的培养基，甲基红测定是在培养 2、6天时滴加一滴甲基红试剂观察颜色变化，红色为阳性，黄色为阴性。 V.P测定同甲基红相同，只是加入的试剂不同，V.P测定是加入肌酸来鉴定的，反应10min，培养基中有红色出现为阳性，有时需放置更长的时间。 3.3吲哚实验使用1胰胨水溶液培养基，在培养1,2,4,7天的培养液中加入35mm高的吲哚试剂于培养基表面，在液层界面发生红色为阳性。 若颜色不明显，可加入45滴乙醚至培养液，摇动，静置片刻，再加入吲哚试剂。 3.4明胶、淀粉的水解将加入明胶的培养基分装于试管中，灭菌，穿刺接种，20培养2，7,10,14和30天。 在20以下的室温观察生长情况和明胶是否液化。 如菌已生长，明胶表面部分或全部变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。 菌落在加入可溶性淀粉的肉汁胨培养基上划线，培养25天，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液，菌落周围有不变色透明圈者为阳性，仍是蓝黑色为阴性。 3.5硝酸盐的利用包括硝酸盐还原，亚硝酸还原，反硝化，产氨反应四个实验将菌种分别接在硝酸盐还原和亚硝酸还原实验得培养基上面，硝酸盐还原实验培养1,3,5天，而亚硝酸还原实验培养1，3，7天，加入格里斯氏试剂A液和B液进行观察，记录颜色变化，根据颜色变化判断阳性和阴性。 硝酸盐还原实验无红色出现，且滴加二苯胺试剂不呈蓝色，为阴性。 亚硝酸盐还原实验，滴加格里斯氏试剂A液和B液，为红色是阴性。 反硝化实验需密封培养，有气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。 在产氨培养基上培养1,3,5天，滴加Nessler试剂，出现黄褐色沉淀为阳性。 3.6接触酶和氧化酶实验接触酶实验是将幼龄培养物与过氧化氢接触，有气泡者为阳性，无气泡者为阴性。 氧化酶实验是将培养24h的菌苔涂抹在被1盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液湿润的滤纸上，观察颜色变化，10s内菌苔现红色者为阳性1060s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，记为阴性。 3.7纤维素分解在无机盐基础培养基中加入优质滤纸条，能将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或变薄者为阳性，滤纸条无变化者为阴性。 3.8酯酶实验（Tween80）菌种在加了Tween80的培养基上划线，培养7天，每天观察。 在生长的周围有模糊的晕圈者为阳性，没有晕圈者为阴性。 3.9脲酶实验将加了尿素的培养基制成斜面，接种培养，分别于2h，4h过夜观察，培养基呈桃红色者为阳性，培养基颜色不变化着为阴性。 二、真菌鉴定流程1表观鉴定查看菌丝的特征，孢子头的特征，足细胞的特征，然后对照微生物真菌守则来查看真菌大概属于哪类，再进行分子鉴定。 2分子鉴定2. 1、真菌DNA提取（试剂盒法）样品（新鲜/冷冻样品）准备将样品收集在1.5或2ul的微量离心管中，用镊子夹管在液氮中冷冻。 用磨杵磨碎，也可以使液氮蒸发后存于-70备用。 杵棒在用过一次后最好放入漂白溶液中直到干净（高压灭菌）收集已磨碎样品100mg于微量离心管中（46个）立即加入FG1600ul充分涡旋混匀。 分散所有块组织。 6510min培养时，颠倒混合样品两次。 FG2140ul涡旋混匀离心10000g10min。 小心吸出上清夜于新离心管中，注意别吸入碎片，异丙醇（0.7v）420ul涡旋使DNA沉淀（大多情况可以吸出600ul上清液，需加入420ul异丙醇即大约0.7volume，但加入量可依吸出量改变）快速离心，10000g2min使DNA呈颗粒状。 吸出去除所有上清液保证不破坏沉淀物，可倒转离心管在纸上吸干液体。 加入无菌水300ul，65涡旋使DNA溶解（可保温65加速溶解）加入RNase4ul混匀（勿剧烈）加入FG3150ul无水乙醇300ul充分混匀，尽量同时加入勿产生沉淀，若产生，反复抽打1015次（勿剧烈）将离心管内所有物质转移到过滤柱中，放入一个2ml的离心管中，离心10000g/min，弃去管及液体，只留柱子。 将柱子放入第二个离心管中，加入Wash Buffer（已加入无水乙醇）700ul，离心10000g/min，弃去液体，管柱留用重复上一步骤，再加入700ul WashBuffer，离心，弃去液体，管柱留用将上一步空管柱在离心最大速(13000g)2min使其干燥，此步很关键，去除残余的酒精，否则会将DNA洗脱影响下面步骤。 将柱子转移入干净的1.5ml管中，加入已预热65Elution Buffer（或无菌水）100ul室温反应23min，离心10000g/min，洗脱DNA。 重复上一步，加入100ul ElutionBuffer，可用另一个管收集来保证第一次收集浓度高。 2. 2、PCR扩增和电泳检测真菌扩增引物（ITS序列）为ITS15-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3；ITS45-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。 真菌PCR扩增体系10buffer5L Mg2+4L dNTP4L引物12引物22L Taq酶2L模板4L双蒸水29L总体积50L PCR的扩增条件预变性温度943min变性温度9450s退火温度501min延伸温度7290s最后终延伸7210min保温4电泳凝胶检测基因组的在2.3kb处，扩增引物在700bp处，如在23kb和700bp处出现亮条带，则操作成功。 2.3测序（华大基因测序和博尚生物测序）2.4DNA分子拼接，由测序公司拼接或者自己用DNAMAN拼接2.5在NCBI上进行核苷酸序列比对以及用MEGA软