分子生物学实验设计-蚕豆病(1).ppt

年级 专业 班级 实验课时间 实验室 组别 第一组 组员 报告人 案例 患儿 男性 3岁 因面色苍白伴血尿1天入院 1天前食用新鲜蚕豆后 今日出现恶心 呕吐 排尿呈酱油样色 面色苍白 据家长反映 患者的姐姐也曾发生过类似情况 临床表现 体格检查 体温38 脉搏150次 分 呼吸40次 分 血压80 60mmHg 呼吸急促 神清 萎靡 面色苍白 皮肤及巩膜黄染 体型较同龄人瘦小 心 肺未及异常 肝 脾未触及 双肾区无叩击痛 神经系统检查未及异常 实验室检查 1 根据上述患儿的临床表现和实验室检查 初步判断患儿是何种疾病 2 请设计实验进一步明确诊断 3 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 必答题 5 患者体型瘦小与该病症是否有关 为什么 选答题 恶心 呕吐 面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞1 98 1012 L 血红蛋白53g L 血清总胆红素85 5 mol L 尿蛋白 尿胆红素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 黄疸 红细胞膜不完整 已破裂 红细胞含量少 含量明显增加 血红蛋白量减少 排尿呈酱油样色 游离胆红素增加 溶血性黄疸 初步诊断为 红细胞葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G6PD 缺乏症 蚕豆病 肠肝循环增多 1 根据上述患儿的临床表现和实验室检查 初步判断患儿是何种疾病 症状 正常红细胞 溶血性贫血红细胞 蚕豆病简介 蚕豆病是一种6 磷酸葡萄糖脱氢酶 G 6 PD 缺乏所导致的疾病 表现为在遗传性葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G 6 PD 缺陷的情况下 食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血 易发人群 多见于儿童 男性患者约占90 以上 发病机制 G6PD NADPH H GSH 红细胞的抗氧化能力 发生溶血 左 健康新生儿右 溶血性贫血患儿 黄疸 早期有恶寒 微热 头昏 倦怠无力 食欲缺乏 腹痛 继之出现黄疸 贫血 血红蛋白尿 尿呈酱油色 此后体温升高 倦怠乏力加重 可持续3日左右 与溶血性贫血出现的同时 出现呕吐 腹泻和腹痛加剧 肝脏肿大 肝功能异常 约50 患者脾肿大 严重病例可见昏迷 惊厥和急性肾衰竭 若急救不及时常于1 2日内死亡 主要临床表现 2 设计实验进一步明确诊断 贫血 黄疸 有和无遗传史 无或有诱因 食用蚕豆 服用药物 感染 体征 脾肿大 黄疸 血常规检查 血清学检查 检查HA的病因 G6PD筛选试验 G6PD确诊试验 Hb 网织红细胞 间接胆红素 尿胆原 游离Hb 结合珠蛋白 怀疑其他HA 相应病因检测结果正常 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定 G6PD基因分析 其他筛选试验 高铁血红蛋白还原试验 初诊或确诊G6PD缺陷症 确诊溶贫 血管内溶血 确诊G6PD 做1项或2项 做1项 高铁血红蛋白还原试验 筛选试验 确诊试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定 实验名称 高铁血红蛋白还原试验 实验一 实验原理 在全血中加入亚硝酸钠 使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白 MHb 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白 在这过程中 高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体 还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应 所以 G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降 分光光度技术 亚铁血红蛋白 NADPH 辅酶 亚甲蓝 递氢体 高铁血红蛋白还原酶 高铁血红蛋白 实验方向 0 18mol L亚硝酸钠 葡萄糖溶液 0 4mmol L亚甲蓝溶液 0 28mol L葡萄糖溶液 混合液 等量 生理盐水 抗凝剂 紫外分光光度计水浴箱 离心机 试管3支 主要试剂和仪器 主要试剂 仪器 实验操作流程 取静脉血1 8mL于抗凝管 混匀抗凝管 含0 2mL109mmol L抗凝剂 葡萄糖20mg 离心沉淀1000r min15min 调整血细胞 血浆 1 1 混匀 调整后全血 备用 1ml0 18mol L亚硝酸钠1ml0 28mol L葡萄糖溶液1ml0 14mmol L亚甲基蓝液 混匀 混合试剂 备用 取试管3支 标上A B S 按下表加入试剂 高铁血红蛋白还原试验操作步骤 混合试剂 mL0 01 生理盐水 mL 0 01 0 18mol L亚硝酸钠 0 010 28mol L葡萄糖溶液 mL经调整的全血 mL0 10 10 1来回摇动15 20次 置37 水浴箱静置3h蒸馏水10 00ml10 00ml10 00ml 试剂ABS B管为空白管 在波长635nm处 测定 A 管及 S 管吸光度 计算高铁血红蛋白还原率公式 MHb 1 A S 100 注意事项 1 血细胞比容比值过低 高铁血红蛋白还原率降低 应将血细胞比容调整到0 35 0 402 细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性 试管等应无菌3 不稳定Hb 高脂血症等均可出现假阳性结果 故应2h内送检4 标本不应有凝血或溶血 故需使用抗凝管5 在标本内应适当加入葡萄糖 以避免较全血缺乏 结果分析方法 正常值 MHb还原率 75 脐血 77 临床诊断 纯合子和半合子 XY 患者 MHb还原率 30 脐血 40 杂合子患者 MHb还原率 31 74 脐血 41 76 实验二 G6PD荧光斑点试验 实验原理 葡萄糖 6 磷酸 G6P 在G6PD作用下形成6 磷酸葡萄糖 6PGA 同时使NADP转变为NADPH 后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光 反应原理如下图 所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟 5分钟 10分钟分别取1滴血到滤纸上 通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性 G6P 6PGA G6PD NADP NADPH 反应液 G 6 P液1份 NADP液1份 皂素2份 磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀 长波紫外灯 滤纸 水浴箱 主要试剂和仪器 试剂 仪器 实验操作流程 取试管 加10 l全血 100 l反应液 混匀 取一滴于滤纸上 第一斑点 作为对照 将上液置于37 水浴10min 再取一小滴滴于滤纸上 第二斑点 实验组 晾干后 于长波紫外灯下 365nm 观察结果 计时 根据结果作出相应诊断 注意事项 1 检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现2 每次试验应用正常标本 已知G 6 PD正常 作阴性对照 如可能选用已知G 6 PD缺乏者的标本作阳性对照3 如贫血严重取血量应相应加大 或用红细胞混悬液进行检验4 为提高敏感性可在反应液中加入1份8 0mmol LGSSG 结果分析 正常人 0min斑点无荧光 5 10min出现 10min荧光最强临床诊断 轻度缺陷者 0 10min荧光很弱或不出现中度缺陷者 10 30min出现荧光严重缺陷者 30min内不出现荧光 实验三 红细胞G6PD活性测定 实验原理 基本原理同G6PD荧光斑点实验 不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性 即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度 测6次 求每分钟吸光度增加的平均值 根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同 方法 WHO推荐的Zinkham NBT定量法等 生理盐水 溶血素 3 8mmol LNADP 0 5mol LTris缓冲液 pH7 5 0 63mol L氯化镁溶液 33mmol LG 6 P液 紫外分光光度计水浴箱 离心机 试管 主要试剂和仪器 试剂 仪器 实验流程 取抗凝血2ml 生理盐水洗涤红细胞3次 1500r min离心10min 除去上清液和乳白层 白细胞和血小板 加等体积生理盐水 红细胞悬液 红细胞悬液0 05ml 溶血素0 5ml 混合 放置10min 溶血液并测定其Hb浓度 进行比色 见下表 G 6 PD活性测定的操作表 Zinkham法 试管对照管测定管 NADP液 ml 0 10 1Tris液 ml 0 10 1氯化镁液 ml 0 10 1蒸馏水 ml 0 680 58G6P液 ml 0 137 预热溶血液 l 2020 立即340nm处测吸光度 以对照管调零 37 恒温 每分钟观察1次 记录吸光度的变化 计算公式 G 6 PD活性 U gHb A min 1000 6 22 1020 20 Hb gL 1 A min 每min吸光度的平均变化值1000 6 22 为微摩尔消光系数1020 20 总容量与溶血液的量之比 注意事项 1 急性溶血期后2 3个月再查或复查G6PD活性2 最好同时作阴性对照和阳性对照 影响因素多 3 离心沉底后应取底层红细胞测定G6PD活性 结果分析 G6PD缺陷者 G6PD活性较正常平均值低40 以上即可作出诊断 方法正常值范围 WHO推荐的Zinkham 12 01 2 09 IU gHb 37 ICSH推荐的Glock与McLoan法 8 34 1 59 IU gHb 37 NBT定量法 13 1 30 0 NBT单位Chapman和Dern法 2 8 7 31 IU gHb 25 根据实验结果 该男孩患蚕豆病 3 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 细胞膜的破坏 胆红素的异常 红细胞膜的破坏 葡萄糖磷酸戊糖途径 葡萄糖6 磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖 NADPH H 磷酸化 5 磷酸核糖 磷酸戊糖途径 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H NADPH维持GSH 谷胱甘肽 的正常含量和还原状态 G6PD 6 磷酸葡萄糖脱氢酶 起关键作用 还原型谷胱甘肽体内重要的抗氧化剂保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏 单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 氧化破坏 血红素 珠蛋白 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏 红细胞 氧化破坏 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 血红蛋白 单核吞