慢病毒介导shRNA关节腔注射可加重骨关节炎的软骨破坏.doc

www.CRTER.org杨二平，等. 慢病毒介导shRNA沉默关节腔注射可加重骨关节炎的软骨破坏慢病毒介导shRNA关节腔注射可加重骨关节炎的软骨破坏杨二平1，彭 飞2，梁 杰1，杜远立1(1三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院，湖北省宜昌市 443000；2武汉大学人民医院，湖北省武汉市 430060)引用本文：杨二平，彭飞，梁杰，杜远立. 慢病毒介导shRNA关节腔注射可加重骨关节炎的软骨破坏J.中国组织工程研究，2016，20(20):2979-2984.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.013 ORCID: 0000-0002-8538-3658(杨二平)文章快速阅读：模型+shLRP1组(关节腔注射慢病毒)；骨关节炎模型组(关节腔注射阴性慢病毒)低密度脂蛋白受体相关蛋白1对软骨组织的作用阴性对照组；假手术组；杨二平，男，1972年生，湖北省蕲春县人，汉族，2015年武汉大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节疾病研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)20-02979-06稿件接受：2016-03-09http:/WWW.制作骨关节炎模型分4组30 min/d观察软骨破坏程度和软骨组织中基质金属蛋白酶13表达64只500 m每组16只造模2、4及6周处死各小组大鼠造模后5 d跑步结果说明：慢病毒介导的siRNA关节腔注射干扰抑制关节软骨的低密度脂蛋白受体相关蛋白1表达对关节软骨有加重损伤的作用。文题释义：低密度脂蛋白受体相关蛋白：能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，不仅可以对血脂的动态平衡及纤溶功能的稳定进行调节，而且能参与多种生长因子、细胞激酶生物学效应的发挥。慢病毒：慢病毒属是反转录病毒科下的一个属，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病，显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期之后缓慢发病，故被称为慢病毒。摘要背景：最近研究表明低密度脂蛋白受体相关蛋白除了参与脂质代谢外，还参与调节炎症反应。目的：观察慢病毒介导的低密度脂蛋白受体相关蛋白1-shRNA对大鼠骨关节炎模型软骨破坏的影响，以及对软骨组织中基质金属蛋白酶13表达的作用，初步判断低密度脂蛋白受体相关蛋白1对体内实验骨关节炎发病进程中的作用。方法：SD大鼠64只分为4组，每组16只。对照组大鼠未做手术为阴性对照组。假手术组大鼠显露关节腔后及关闭切口，不切断交叉韧带和半月板。模型+shLRP1组大鼠切断前交叉韧带切断加内侧半月板部分切除制作骨关节炎模型，造模后2 d用慢病毒介导的siRNA关节腔注射，每周1次，连续2周。骨关节炎模型组，造模后关节腔注射阴性对照慢病毒。4组大鼠造模后5 d开始在自制的电动跑步机中跑步，每日跑步30 min，里程为500 m。造模2，4及6周处死各小组大鼠，观察软骨破坏程度和软骨组织中基质金属蛋白酶13表达。结果与结论：大体和病理切片观察发现：行关节腔注射慢病毒介导的siRNA抑制关节软骨的低密度脂蛋白受体相关蛋白1表达后，大鼠骨关节炎模型中软骨破坏加重，加速骨关节炎病程。6周时：模型+shLRP1组Mankins评分明显高于其他3组(P 0.05)，模型+shLRP1组软骨细胞基质金属蛋白酶13阳性率明显高于其他3组(P 0.05)。结果说明：前叉韧带切断加内侧半月板部分切除并配合跑步机中慢跑锻炼能再现骨关节炎模型。慢病毒介导siRNA关节腔注射可干扰抑制关节软骨中的低密度脂3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 蛋白受体相关蛋白1表达，对关节软骨有加重损伤的作用。关键词：组织构建；软骨组织工程；骨关节炎；低密度脂蛋白受体相关蛋白1；慢病毒；前交叉韧带；关节腔注射；国家自然科学基金主题词：骨关节炎；慢病毒属；前交叉韧带；组织工程基金资助：国家青年科学基金(61308110)缩略语：低密度脂蛋白受体相关蛋白：The lipoprotein receptor low-density lipoprotein receptor-related protein，LRPLentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritisYang Er-ping1, Peng Fei2, Liang Jie1, Du Yuan-li1 (1Three Gorges University Peoples Hospital, Yichang First Peoples Hospital, Yichang 443000, Hubei Province, China; 2Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Emerging evidence demonstrates that low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) is involved in lipid metabolism and regulation of inflammatory reaction.OBJECTIVE: To explore the effect of lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 on cartilage damage and matrix metalloproteinase 13 in a rat model of osteoarthritis, so as to assess the role of low density lipoprotein receptor-related protein 1 in the pathogenesis of osteoarthritis.Yang Er-ping, M.D., Attending physician, Three Gorges University Peoples Hospital, Yichang First Peoples Hospital, Yichang 443000, Hubei Province, ChinaMETHODS: Sixty-four Sprague-Dawley rats were included and ramdomly divided into four groups (n=16 for each): negative control group, no surgery; sham-surgery group, only the articular cavity of the knee was exposed; osteoarthritis plus shLRP1 group, rat osteoarthritis models were established by cutting anterior cruciate ligament and removing the medial meniscus partly followed by an intra-articular injection of lentivirus-mediated siRNA at 2 days after surgery, once a week for 2 consecutive weeks; osteoarthritis group, an intra-articular injection of the negative control lentivirus was performed after surgery. Rats in the four groups started running on the self-made electric treadmill from 5 days after modeling, 30 minutes per day, totally 500 meters. Cartilage damage and matrix metalloproteinase 13 expression in cartilage tissues were determined at 2, 4, 6 weeks after surgery.RESULTS AND CONCLUSION: Gross and pathological observations showed that lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravated cartilage damage in the rat model of osteoarthritis. At 6 weeks after surgery, Mankins score and matrix metalloproteinase 13 expression in the cartilage tissues in osteoarthritis plus shLRP1 group were significantly increased compared with other three groups (P 0.05). These findings indicate that a simulation model of osteoarthritis is developed by cutting anterior cruciate ligament and removing the medial meniscus partly combined with running on the treadmill. Lentivirus-induced knockdown of LRP1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritisSubject headings: Osteoarthritis; Lentivirus; Anterior Cruciate Ligament; Tissue EngineeringFunding: the National Science Foundation for Young Scientists of China, No. 61308110Cite this article: Yang EP, Peng F, Liang J, Du YL. Lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(20):2979-2984.2981ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction目前骨关节炎的病因及发病机制尚未完全明确。研究显示白细胞介素1和肿瘤坏死因子作用于软骨细胞干扰软骨细胞合成和分解代谢平衡，分解代谢增强，软骨细胞分泌多种基质降解酶1。与骨关节炎相关的炎症递质中，肿瘤坏死因子被认为是软骨退变关键的炎性调节因子，肿瘤坏死因子促进滑膜细胞和软骨细胞表达炎性因子和趋化因子并维持局部炎性因子。最近研究表明低密度脂蛋白受体相关蛋白(The lipoprotein receptor low- density lipoprotein receptor-related protein，LRP)除了参与脂质代谢外，还参与调节炎症反应2-3。因此，LRP被认为有可能参与调节骨关节炎发病进程。而骨关节炎是机械负荷因素和体内细胞环境因素相互作用下关节软骨基质的合成和分解代谢不平衡结果，体外实验骨关节炎动物模型目的是再现骨关节炎相关的病理过程，模拟力学因素和生物学因素对软骨组织的影响。构建骨关节炎大鼠模型后，将细胞实验证明能有效敲低表达LRP1的慢病毒注入造模侧关节腔内，观察6周，观察期内每天给予必要的机械负荷刺激并评价大鼠骨关节炎模型软骨组织的破坏程度，判断LRP1对软骨组织的作用。图1 大鼠在电动跑步机跑步训练Figure 1 Rats ran on the electric treadmill for exercise图注：跑步机转速为8.5 m/min，大鼠每日跑步里程为500 m，无不良反应。DCBA图2 各组大鼠造模后6周关节组织苏木精-伊红染色(镜下观察，100)Figure 2 Hematoxylin and eosin staining of articular cartilage tissue in each group at 6 weeks after surgery (100)图注： 图A为对照组；B为假手术组；C为骨关节炎模型组；D为模型+shLRP1组。DCBA图3 各组大鼠造模后6周关节组织番红固绿染色(镜下观，100)Figure 3 Safranin-O and fast green staining of articular cartilage tissue in each group at 6 weeks after surgery (100)图注：图A为对照组；B为假手术组；C为骨关节炎模型组；D为模型+shLRP1组。DCBA图5 各组大鼠造模后2周膝关节软骨组织免疫组织化学病理切片(镜下观，200)Figure 5 Matrix metalloproteinase 13 immunoreactivity in articular cartilage tissue in each group at 2 weeks after surgery (200)图注：图A为对照组；B为假手术组；C为骨关节炎模型组；D为模型+shLRP1组。对照组骨关节炎模型组模型+ shLRP1组a基质金属蛋白酶MMP13(%)806040200a假手术组Mankins 评分151050a对照组 假手术组 骨关节炎模型组 模型+shLRP1图6 各组大鼠造模后2周软骨细胞基质金属蛋白酶13阳性率比较Figure 6 Quantification of matrix metalloproteinase 13 immunoreactivity in articular cartilage tissue in each group at 2 weeks after surgery图注：取任意方向的3个视野内阳性细胞个数的平均值。模型+shLRP1组软骨细胞基质金属蛋白酶13阳性率明显高于其他3组(aP 0.05)。2周 4周 6周图4 各组大鼠Mankins评分情况Figure 4 Mankins scores in rats in each group图注：4周时模型+shLRP1组评分高于对照组和假手术组；6周时模型+shLRP1组明显高于其他3组(P 0.05)。关节腔注射shLRP1会加重软骨磨损。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 分组对照观察。1.2 时间及地点 实验于2014年6至11月在武汉大学人民医院动物实验中心完成。1.3 材料 实验动物：健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠64只，体质量150-200 g，由武汉大学实验动物中心提供，分笼饲养每笼5只，自由饮食。以慢病毒为载体的shRTNA由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。1.4 实验方法1.4.1 大鼠骨关节炎模型的建立 雄性SD大鼠64只随机分为4组，每组16只，其中2组制作骨关节炎模型将髌骨推向外侧，膝关节屈曲位，显露内侧半月板和前交叉韧带，切断前交叉韧带附着点，切除内侧半月板前l/3部分；16只对照组大鼠为未做手术阴性对照组；16只假手术组大鼠显露关节腔后及关闭切口，不切断交叉韧带和半月板。16只造模大鼠为模型+shLRP1组术后2 d用慢病毒介导的siRNA关节腔注射(20 L，1108 TU/mL)，每周1次，连续2周。16只为骨关节炎模型组，造模后关节腔注射阴性对照慢病毒。4组大鼠术后5 d开始在自制的电动跑步机中跑步，每日跑步30 min，里程为500 m。1.4.2 关节软骨大体观和软骨组织病理学观察 各组大鼠骨关节炎造模后切口愈合良好，造模2，4及6周处死各小组大鼠5只，打开造模侧关节腔，观察造模侧股骨髁及胫骨平台的病理改变，并行软骨组织苏木精-伊红和番红快绿染色。按改良Mankin评分标准对各组股骨髁磨损程度评分1，此改良评分结合大体观察和镜下软骨组织和滑膜组织病变等级评分：0-15分。苏木 精-伊红染色和番红快绿染色检测软骨组织胶原蛋白和纤维组织，红色代表胶原纤维，绿色代表钙化的炎性纤维组织。软骨组织病理改变分0-4级(按钙化炎性纤维组织侵犯程度)：0级为正常；1级为软骨表面少许纤维增生；2级为表层和中层软骨组织破坏，伴有纤维组织增生，软骨细胞排列紊乱，软骨基质破坏；3级为破坏达深层，纤维化组织代替软骨组织，可见少许软骨细胞及基质；4级为破坏达软骨下骨伴有钙化。1.4.3 软骨组织免疫组织化学染色基质金属蛋白酶13阳性细胞计数 染色成功后的切片置于正置显微镜下(Olympus IX70)观察拍片,使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析计数阳性细胞，取任意方向的3个视野内阳性细胞个数的平均值。1.5 主要观察指标 各组大鼠软骨组织病理学观察及评分。软骨组织免疫组织化学染色基质金属蛋白酶13阳性细胞计数。1.6 统计学分析 计量实验数据以s表示，采用方差分析进行统计学处理，P 0.05表示差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠64只，分为4组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。2.2 大鼠骨关节炎生物力学模型的建立 每组大鼠在电动跑步机跑步训练，跑步机转速为8.5 m/min，大鼠每日跑步里程为500 m。在6周的观察期内各组大鼠均能适应跑步机，完成每天的跑步里程无不良反应(见图1)。2.3 各组大鼠软骨组织病理学评分 每组大鼠分别于造模后2，4和6周麻醉处死，对参与关节大体观评分与病理切片镜下观察的评估人员采用盲法原则，评分者事先不知道实验的分组情况。 对照组和假手术组关节软骨面光滑，色泽明亮无明显关节积液及滑膜增生，关节软骨面光滑，色泽明亮。骨关节炎模型组和模型+shLRP1组2周时，2组大鼠的造模关节开始出现关节积液、轻度滑膜增生，内侧髁股骨关节软骨面出现轻微的黄色班点。模型+shLRP1组除了以上表现外，软骨表面出现斑点状出血灶和粗糙的纤维增生；4周时，对照组和假手术组关节表面光滑。骨关节炎模型组和模型+shLRP1组造模关节出现关节积液增多和滑膜增生，关节面粗糙以股骨内侧髁关节面为甚，关节面有炎性纤维组织覆盖。骨关节炎模型组表层软骨斑点状磨损，而模型+shLRP1组磨损波及软骨中层，磨损软骨周围有纤维组织增生；6周时，全部造模关节滑膜增生明显，骨关节炎模型组关节面磨损波及中层伴有大量纤维增生附着，模型+shLRP1组软骨磨损可波及深层，严重者可见裸露的软骨下骨，部位仍以内侧髁关节面为主，在6周时部分伴有骨赘形成。为了观察敲低LRP1后对骨关节炎的病程最终影响，取4组大鼠造模后6周处死后的股骨内髁标本行苏木精-伊红染色和番红固绿染色。苏木精-伊红染色后的对照组和假手术组关节切片提示两组软骨磨损不明显，骨关节炎模型组软骨磨损波及软骨组织中层，伴有大量纤维组织增生覆盖。番红固绿染色提示软骨层变薄，表面有大量染成绿色的胶原纤维增生；模型+shLRP1组软骨组织磨损波及深层，大量炎性纤维组织覆盖，部分软骨组织被纤维化，番红固绿染色提示大量染成绿色的胶原纤维增生和软骨钙化表现，部分波及软骨下骨，软骨层进一步变薄。Mankins 评分模型+shLRP1组明显高于其他3组。这些改变提示模型+shLRP1组符合骨关节炎晚期表现(见图2-4)。2.4 软骨组织免疫组织化学染色基质金属蛋白酶13阳性细胞计数 4组大鼠造模后2周，膝关节软骨组织免疫化学病理切片镜下观，软骨细胞基质金属蛋白酶13阳性率比较。取任意方向的3个视野内阳性细胞个数的平均值。模型+shLRP1组软骨细胞基质金属蛋白酶13阳性率明显高于其他3组，差异有显著性意义(P 0.05)，见图5，6。3 讨论 Discussion低密度脂蛋白相关蛋白是已知的具有内吞作用的受体之一，它不仅参与识别和内吞脂质，而且能识别大量非脂质体，包括LRP-1通过胶原酶3受体来调节基质金属蛋白酶家族水平，胶原酶3受体为膜受体内吞基质金属蛋白酶132。作者假设关节软骨细胞LRP1低表达时会加重骨关节炎模型大鼠的关节炎进展。因此，实验通过关节腔注射慢病毒介导的RNAi技术实现对关节软骨细胞LRP1表达降低，能否加重大鼠骨关节炎。为了实现对软骨细胞的LRP1的降低，利用成功构建的含有目的靶点的干扰RNA。用慢病毒为载体的RNAi 技术以MOI值为20时成功敲低软骨细胞LRP1的表达。成功转染的软骨细胞能维持低表达LRP1约14 d3-4。为了维持在本观察期内关节软骨细胞能持续低表达LRP1，连续2周用慢病毒注射关节腔，每周2次。在观察期内，大鼠未见明显异常反应。为了进一步阐述LRP1在骨关节炎中的作用，作者选择前叉韧带切断加内侧半月板前1/3切除诱导大鼠骨关节炎模型。同时，为了每天给予力学因素刺激关节软骨，造模后的大鼠在跑步机中爬行。适当的力学负荷刺激是调节软骨细胞代谢活动的基本要素，它能维持软骨细胞外基质的正常性能。过度的机械负荷有助于加重软骨的退变5-7。在实验中，对照组和假手术组爬行训练后的2，4，6周的关节大体观中未见到软骨表面磨损，且组织切片苏木精-伊红染色也未见软骨组织磨损，因此，在跑步机中每天500 m的爬行距离对于大鼠来说是合适的。经过6周的爬行活动后，骨关节炎模型组和模型+ shLRP1组苏木精-伊红染色提示两组软骨组织均有不同程度的磨损，但模型+shLRP1组软骨组织磨损波及软骨下骨。对照组和假手术组大鼠6周的番红固绿染色未见明显的软骨组织成分改变，而骨关节炎模型组和模型+shLRP1组提示软骨层变薄，表面有大量染成绿色的胶原纤维增生，模型+shLRP1组软骨组织磨损波及深层，大量炎性纤维组织覆盖，部分软骨组织被纤维化，大量染成绿色的胶原纤维增生和软骨钙化表现，部分波及软骨下骨，软骨层进一步变薄。由前叉韧带切断术加内侧半月板前1/3切除术诱导骨关节炎模型一般需8周时间8，在实验中骨关节炎模型组在6周时出现骨关节炎样改变，并且模型+shLRP1组在造模后6周出现磨损的软骨组织表面增生的纤维组织钙化。实验结果提示作为炎症抑制因子，LRP1在骨关节炎早期病变中也许更具有保护作用延缓骨关节炎病程。 LRP1调控细胞生存、炎症反应，也可以调控细胞外基质蛋白水解，生长因子活性甚至免疫反应9。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases， MAPKs)是胶原酶降解胶原蛋白机制之一10-14，敲低LRP1会激活丝裂原激活的蛋白激酶途径，因此，LRP1也许是重要的软骨代谢调节因子。关节软骨组织生长是动态合成和分解代谢平衡过程，而炎性细胞，滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生的促炎性因子(肿瘤坏死因子和白细胞介素1破坏这种平衡15。在前叉韧带切断诱导的大鼠骨关节炎模型中和骨关节炎患者的关节滑液中能检测到促炎因子水平升高16-18。软骨细胞是肿瘤坏死因子和白细胞介素1作用的靶细胞，能抑制软骨细胞的合成代谢及细胞外基质的合成和激活分解代谢。模型+shLRP1组在4周时表现出软骨磨损伴有大量纤维组织增生，在6周时增生的胶原纤维钙化，很少有活性细胞。细胞外基质的降解是伴随着活性软骨细胞减少，这符合骨关节炎的慢性基质重塑的特点19。软骨细胞合成胞外基质蛋白多糖和胶原蛋白维持软骨的机械强度和韧性，LRP1能抑制肿瘤坏死因子诱导的炎症反应主要是通过抑制细胞核因子B通路和MAPKs通路20。通过这两个信号途径，LRP1能下调基质金属蛋白酶13的表达，基质金属蛋白酶13主要降解软骨组织型胶原和蛋白多糖。免疫组织化学染色分析提示在2周时的模型+shLRP1组基质金属蛋白酶13表达水平明显增加。 研究表明，在骨关节炎早期的动物模型中，具有抗炎作用的LRP1对骨关节炎的软骨具有保护作用。这一发现也许为骨关节炎临床治疗提供新的思路。作者贡献：第一作者负责设计和实施，第二作者负责实施及文章的修改。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验均经武汉大学人民医院医学伦理部门审核并批准。实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Lee YJ, Park JA, Yang SH, et al. 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