微生物限度检查操作规程2015.doc

微生物限度检查操作规程1. 目的建立微生物限度检查操作规程，确保检查结果准确、可靠。2. 范围本公司纯化水、产品的初始污染菌检查3. 职责质量部QC4. 依据2015版中国药典通则1105GB/T19973.1-2005/ISO11737-1:1995 医疗器械的灭菌 微生物学方法 第部分：产品上微生物总数的估计GB159801995一次性使用医疗用品卫生标准GB159792002一次性使用卫生用品卫生标准5. 内容5.1. 微生物限度检查环境5.1.1. 微生物限度检查应在不低于10000级背景下，局部100级的环境（同等级别的超净工作台）下进行。5.1.2. 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。5.1.3. 对微生物限度检查实验室及超净工作台环境进行定期监测。5.2. 培养基、稀释液、缓冲液5.2.1. 胰酪大豆胨琼脂培养基：市售干粉培养基5.2.2. 沙式葡萄糖琼脂培养基：市售干粉培养基5.2.3. R2A培养基：市售干粉培养基5.2.4. PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。5.2.5. 0.9%无菌氯化钠溶液。5.3. 培养基适用性检查5.3.1. 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代(从菌种存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株的生物学特性 。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003 铜绿假单胞菌CMCC(B)10 104 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501 白色念珠菌CMCC(F)98 001 黑曲霉CMCC(F)98 0035.3.2. 菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养23天，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小于100cfu(菌落形成）的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，2025培养57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml孢子数量小于100cfu的孢子悬液。菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28 在24h 内使用。黑曲霉孢子悬液存在28，在验证过的贮存期内用。5.3.3. 阴性对照：阴性对照应无菌生长。若阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。5.3.4. 培养基适用性检查：接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，胰酪大豆胨琼脂培养基平板置3035，培养不超过3天；沙氏葡萄糖培养基平板置2025，培养不超过5天。每一试验菌平行做2皿。同时，用相应的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。被检培养基和对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的一致。5.3.5. R2A培养基适用性检查同胰酪大豆胨琼脂培养基。试验菌种为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。5.4. 供试液制备5.5. 供试品检查5.5.1. 平皿法：平皿法包括倾注法和涂布法。每种培养基至少制备2个平皿。5.5.1.1. 倾注法：取制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入2025ml温度在5055的胰酪大豆胨琼脂或沙式葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，置规定温度下，倒置培养。5.5.1.2. 涂布法：取2025ml温度在5055的胰酪大豆胨琼脂或沙式葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿中，凝固，制成平皿，去制备的供试液少于0.1ml，均匀涂布与平板上，置规定温度下，倒置培养。5.5.2. 薄膜过滤法：薄膜过滤法所才用的滤膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不超过1000ml，以免滤膜上的微生物受损伤。取相当于1g、1ml或10cm2供试品的供试液，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙式葡萄糖琼脂培养基平板上，置规定温度下培养。5.5.3. 培养和计数：除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035培养35天，沙式葡萄糖琼脂培养基平板在2025培养57天，观察菌落生长情况，点计平板上所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌落数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的平均菌落数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。滤膜的培养及计数同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。5.5.4. 菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级；霉菌、酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品所含的微生物数，去两位有效数字报告。薄膜过滤法的菌数报告，以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数。若各稀释级的平板或滤膜上，无菌生长，以1报告菌数，或1乘以最大稀释倍数的值报告菌数。5.6. 纯化水微生物限度检查：按薄膜过滤法检查，转移滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板，置3035培养不少于5天。计数，报告。5.7. 结果判断：若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若有其中一项不符合该品种下的规定，判供试品不符合规定。需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基或R2A琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙式葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素的沙式葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基进行霉菌和酵母菌总数测定。选择性培养基使用前因进行培养基适用性检查。6. 相关文件洁净区尘埃粒子监测操作规程洁净区沉降菌监测操作规程实验室洁净区清洁、消毒操作规程洁净区环境监测管理规程SPX-150型生化培养箱使用、维护操作规程MJK-150型霉菌培养箱使用、维护操作规程SW-CJ系列洁净工作台使用、维护规程阳性菌种管理规程7. 记录微生物限度检查原始记录微生物限度检查原始记录 检验编号：检品品名检品来源批 号规 格数 量 检验日期年 月 日报告日期年 月 日检验依据微生物限度检查操作规程检查结果平皿： R2A琼脂培养基 制备批号： 胰酪大豆胨琼脂培养基 制备批号： 沙式葡萄糖琼脂培养基 制备批号： 稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 其他 配制批号： 材料： 微孔滤膜 规格 设备： MJX-150霉菌培养箱 （2025） 仪器编号： SPX-150生化培养箱 （3035） 仪器编号： 供试液制备：检查：取供试液 ml，采用薄膜过滤法，依法检查。净化工作台环境监测 温度： 湿度： % 沉降菌标准（培养温度：3035）：1cfu/皿 碟号培养时间 123结果判断培养48h菌落数 类别 结果时间需氧菌计数（cfu/皿）霉菌和酵母菌计数（cfu/皿）平行1平行2阴性平行1平行2阴性第一天第二天第三天第四天第五天第六天第七天结果注：逐日观察计数，阴性无菌生长用“-”表示微生物限度检查结果： 符合规定 不符合规定检验人/日 期： 复核人/日 期： 微生物限度检查原始记录 检验编号：检品品名检品来源批 号规 格数 量 检验日期年 月 日报告日期年 月 日检验依据微生物限度检查操作规程检查结果培养基： R2A琼脂培养基 配制批号： 胰酪大豆胨琼脂培养基 配制批号： 沙式葡萄糖琼脂培养基 配制批号： 稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 其他 配制批号： 设备： MJX-150霉菌培养箱 （2025） 仪器编号： SPX-150生化培养箱 （3035） 仪器编号： 供试液制备：检查：取供试液 ml，采用平皿法，依法检查。净化工作台环境监测 温度：