EN在血管重建早期的作用.ppt

RoleofthePhosphatasePTENinEarlyVascularRemodeling 磷酸酶PTEN在早期血管重建中的作用 发表日期 2013年4月杂志 PLOSONEIF 3 534 研究背景及目的 磷酸酶PTEN是PI3K 磷脂酰肌醇 3 羟激酶 蛋白激酶B Akt 信号通路的一种重要的生理学抑制剂 在过去的研究中 我们致力于研究在体内和体外情况下PTEN在血管急性损伤后VSMC凋亡方面的作用 然而 PTEN在血管成形术诱导的血管损伤的早期阶段的作用尚不明了 为了明确该作用机制 我们设计该实验以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用 技术路线 1 体内 颈动脉损伤模型构建 2 体外 成年Wistar大鼠 300g 颈总动脉分离 未处理 对照 球囊损伤 12h后 PTEN表达量检测 取材 HcASMC 细胞培养至第六代 干预24h 转染 共转染PTEN 活化的Akt突变体 血清 不同生长因子 周期性拉伸装置 H2O2 WT PTEN质粒 SiRNA 敲出PTEN基因 凋亡VSMC数量检测 Akt磷酸化检测 VSMC凋亡数量检测 3 汇总数据 统计分析 得出结论 PTEN表达量检测 实验结果报告 图1A D 为了探究血管受损后PTEN的表达及细胞凋亡情况 研究人员对实验大鼠颈动脉进行球囊损伤 12小时后 免疫组化检测各项指标如上图 PTEN green apoptoticsmoothmusclecells TUNELstaining red andnuclei DAPI blue 由图可知 球扩后损伤较严重的区域PTEN表达量较多 正常细胞数量少 凋亡细胞数量密集 图上半部分 实验结果报告 图1E F westernblot usingaspecificPTENantibody 微管蛋白 不同时间点PTEN相对表达量densitometricanalysisofimmunoblots 对经 未经球扩后的标本裂解后通过免疫沉淀反应进行PTEN活性检测 ImmunoprecipitationsemployinganIgGiso antibodyandwithoutadditionofanyantibodiesservedascontrols 由图可知 在大鼠颈动脉受损后12H内 PTEN的表达具有时间依赖性 递增 与对照组相比 其活性明显高于未受损的大鼠颈动脉标本 时间依赖性 实验结果报告 图2A E A Lysatesofcellsexposedtomechanicalforcesusingastretchingdevicewereanalyzedbywesternblottingusingspecificantibodies B LysatesofSMCexposedtogrowthmedium FCS Cdk4 周期素依赖性激酶 servedasloadingcontrol C LysatesofSMCexposedtooxidativestressusing500mMH2O2 p53andCdk4servedasapoptoticmarkerandloadingcontrol respectively D PTEN相对表达量的检测 quantifiedbydensitometricanalysisofimmunoblots E PTEN的活性检测 phosphataseactivityassayofimmunoprecip itatedproteinfromlysatesofHcASMC注 PTEN 抗PTEN抗体 Bpv 一种PTEN的特异性抑制剂 由图可知 PTEN受H2O2的氧化应激刺激后表达显著增加 且上调的PTEN活性可被Bpv抑制 为了探究哪些因素可以诱导PTEN的表达设计如下实验 实验结果报告 图3A C A HcASMCtransfectedwithaplasmidcarryingWT PTENoracontrol empty vector PTENprotein expressionlevelsweredeterminedbyimmunoblottingHcASMCweretransfectedasfollows nontransfected NT transfectedwithanemptyplasmidwithoutPTEN cDNA pControl transfectedwithaplasmidcodingforPTEN pPTEN B SMCwereincubatedinbasalmedium C SMCwereincubatedinbasalmediumsupplementedwithH2O2andtherelativenumberofapoptoticcellswasevaluatedfollowingTUNELstaining 由图可知 转染了WT PTEN质粒的HcASMC其PTEN表达明显增多 凋亡的细胞数显著增多且在基础培养基中加入H2O2之后更明显 为了进一步探究PTEN的上调与SMC凋亡的关系进行如下实验 实验结果报告 图4A C A Proteinexpressionwasdeterminedbywesternblotting DetectionofCdk4servedasaloadingcontrol SMCtransfectedwithsiRNAtargetingPTENorascrambledcontrolwereincubatedinbasalmediumintheabsence B orpresenceofH2O2 C SMCweretransfectedasfollows nontransfected NT mocktransfected withoutsiRNA butwithlipidcarrier transfectedwithanon targeting scrambled siRNA ControlsiRNA transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN PTENsiRNA 由图可知 与对照组相比 经siRNA敲出PTEN基因之后 VSMC的PTEN表达量明显减少 凋亡的SMC数量亦显著减少 敲出PTEN基因后PTEN的表达及凋亡细胞数量变化 实验结果报告 图5A C A Akt磷酸化检测 westernblot AnantibodyagainsttotalAkt PanAkt wasusedascontrol B PI3 K inhibitorLy294002 50nM wassupplementedtothemediumfornot transfectedcells HcASMCweretransfectedasfollows nontransfected NT transfectedwithaplasmidcodingforGFP pGFP transfectedwithanemptyplasmidwithoutPTEN cDNA pControl transfectedwithaplasmidcodingforPTEN pPTEN mocktrans fected withoutplasmid butwithtransfectionreagent PTEN andAktco overexpressionreversesPTENsproapoptoticeffect C 注 GFP 绿色荧光蛋白 由图可知 与对照组相比 转染了PTEN质粒的HcASMC其Akt磷酸化明显减弱 在未转染组中加入PI3K抑制剂 Ly294002 之后Akt磷酸化也明显减弱 当共转染了PTEN质粒和活化的Akt之后可以部分翻转SMC凋亡 为了探究PTEN与Akt磷酸化及细胞凋亡的关系 进行如下实验 实验结果报告 图6A B A 生长培养基 FCS 培养条件下SMC增殖测定 PTENoverexpressionattenuatesserumInducedHcASMCproliferation A HcASMCtransfectedwithaplasmidcarryingWT PTENoracontrolvectorcarryingGFPalonewereincubatedeitherinbasalmediumorgrowthmediuminthepresenceofBrdU B 基础 生长培养基培养条件下SMC增殖测定 HcASMCweretransfectedasfollowing transfectedwithanon targeting scrambled siRNA ControlsiRNA transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN PTENsiRNA 由图可知 与对照组相比 转染了WT PTEN质粒后SMC增殖明显减少 敲出PTEN基因后其增殖