应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏.doc

应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏摘要：本文主要针对应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏和滴定过程中的各 个细节及其相应的注意事项进行总结，为从事蛋白质测定工作的检测人员提供参考和帮助。关键词：蛋白质 测定原理 注意事项the experimental summary of kjeldahl nitrogen determination methodszhangguozhi jinan hanon instruments co., ltdabstracts: this article mainly aimed at mirco-kjeldahl determination methods and the digestion, distillation and titration process. summarized the experimental details and their corresponding notes.for the inspection staff in such work provides reference and help.key word: protein, nitrogen determination, notes以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很好， 广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同，主要区别 在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小，实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过 程分为消解、蒸馏、滴定三步。要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度，认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项，就显得 尤为重要。本文就此进行深入的探讨。二、实验过程操作1、主要试剂的配制40%氢氧化钠：化学纯 400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。2%硼酸：纯 20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。0.05mol/l盐酸：纯 4.2ml盐酸定容至1000ml，通过无水碳酸钠标定。混合指示剂：把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l%甲基红溶液1份混合而成.2、实验过程注意事项(1) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。固体样品一般取样范围为0.20g2.00g;半固体试样一般取样范围为2.00g5.00g;液体样品取 样10.0ml25.0ml(约相当氮30mg40mg)。若检测液体样品，结果以g/100ml表示。样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。(2) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消 化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热 消化至完全。(3)消化时，不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样 品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存 在的情况下，使氮有损失。海能公司消解炉sh220或sh520能够很好的解决此问题。(4)如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗 或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量;加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点;催化剂硫酸铜在有机物全部消化后，溶液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消 化终点。此外，硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 过氧化氢，为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的气泡现象。(5)向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加 热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物cu(nh3)42+ ， 加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知，当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色;当氢氧化钠量不足时就无黑色氧 化铜产生而使溶液呈淡蓝色，所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。(6)因蒸馏时反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停火 断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再 蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密ph试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使用半微量法，因为如果蒸馏失败的 话，半微量法还可继续蒸馏，而常量法只好全部重来，费时费力。我们使用海能k9840经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。(8)吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01n碱液滴定，而以硼酸为氨的吸收液，可省 去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。另外，硼酸吸收液的温度不应超过40，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏 低。可把接收瓶置于冷水浴中。(9)在盐酸标准溶液的配制时，必须将基准无水碳酸钠于270-300灼烧至恒重后称取所须用量，否则也会影 响蛋白质测定结果的准确性。盐酸标准溶液的浓度，常量法中取0.1m比较合适，半微量法中则在0.020.05m之间比较合适。三、讨论凯氏定氮法作为目前法定的国标方法与我们的工作密不可分，本文主要通过综述凯氏定氮法操作的细节及注意事项，为 关注此检测方法的从业人员提供一定的帮助，