乳酸菌的分离纯化.doc

乳酸菌的分离与纯化1.实验目的2.实验材料 2.1试验设备天平、 牛角匙、 电炉、 pH试纸、 刻度搪瓷杯、 量筒、 漏斗 、漏斗架、 玻璃棒、 试管、 棉塞、 培养基、 吸管、 牛皮纸、 线绳 、标签、 500mL锥形瓶两个、 250mL锥形瓶两个、 试管20只、 500mL烧杯两个、 250mL烧杯两个、 100mL烧杯两个、 酒精灯、 石棉网、 接种针（环）。 2.2实验仪器 50L的高压蒸汽灭菌锅、 恒压干热灭菌箱 、 超镜台、 光学显微镜、 75%酒精棉、 冰箱。 2.3实验药品 新鲜酸奶、 脱脂奶粉或全脂奶粉、 蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、 酵母膏、 琼 脂、 结晶紫染液、 卢戈氏碘液、 95%乙醇、 诗坛酸复红染液。3.试验方法及操作过程 3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80灭菌20min。（B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121灭菌2.min。 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。 3.2倒BCG培养基平板的方法 将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115灭菌15min。 3.4乳酸菌的分离纯化 取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40培养824h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 3.5乳酸发酵及检查 发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，4042静止培养。 检测：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色，显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。3.6实验具体过程两周实验具体过程521 上午 清洗仪器、 下午 配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板 下午 乳酸菌、划线分离、配脱脂乳试管100ml、灭菌、装10支试管522 上午 配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板 下午 等待灭菌523 上午 第一代接到脱脂乳试管、培养24h(21日平板仍染菌选相似菌落乳酸菌为第一代) 下午 做无菌水（20min灭菌121）、空锥形瓶灭菌装清明酸奶划线分离524 上午 配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、脱脂乳试管第二代划线分离、脱脂乳试管做革兰氏染色 下午 等待灭菌526 上午 配BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、第三代划线分离（光明由于染菌就此终断光明的接种） 下午 等待灭菌527 上午 第三代接种到脱脂乳试管中 下午 配制BCG牛乳培养基100ml、灭菌、倒平板（先B后A）、528 上午 27日平板染菌，将剩余BCG牛乳培养基灭菌、倒平板、用脱脂乳试管做第四代划线分离及革兰氏染色 下午 等待灭菌529 上午 配酸奶培养基100ml两瓶、灭菌、冷却至不烫手为宜将第四代接种到酸奶培养基、待凝固 下午 写实验报告3.8.实验分析 用提前灭好菌的烧杯取少量从市场上购买的（伊利、蒙牛）新鲜酸奶，用接种环将两种酸奶接入已经配好的BCG培养平板中（注意整个过程应在无菌条件下操作），接好种后帖上标签进行培养。 培养后的平板上大多都染上了杂菌，杂多为灰白色，只要个别平板长有淡黄色的乳酸菌菌落，且长势不好。 第一代：选择长势较好的乳酸菌菌落，用接种针在无菌条件下将菌种接入两只脱脂乳试管中，接好种后帖上标签进行培养。 结果：两只脱脂乳试管，一支凝固较好，颜色为乳白色略显黄，表面有淡黄色上清液，一支凝固不好。 对试管中的酸奶进行了革兰氏染色，现象如下： 显微镜下：有3种菌，革兰氏染色为紫色，有球菌、链球菌和少量细长的杆菌 第二代：选择凝固较好的脱脂乳试管，用接种环在无菌条件下将菌种接入BCG培养平板中，接好种后帖上标签进行培养。培养结果：平板上没有长出较好的菌落，且长有杂菌。杂菌的菌落为突起的水泡、灰白色，经革兰氏染色为紫色，为粗短的杆菌有荚膜。有的平板长有少量的乳酸菌，颜色为乳白色略显黄。染菌的平板 第三代：选择长势较好的乳酸菌菌落，用接种针在无菌条件下将菌种接入剩余八只脱脂乳试管中，接好种后帖上标签进行培养。 培养结果：八只脱脂乳试管中，有六只支凝固较好，颜色为乳白色略显黄，表面有淡黄色上清液，两支凝固不好。 对试管中的酸奶进行了革兰氏染色： 凝固效果较差成絮状，颜色为乳白色，表面有淡黄色上清液。显微镜下：革兰氏染色为紫色，含粗短和细短的杆菌，两者含量都少。 凝固效果极好，白色，几乎没有液体。显微镜下：革兰氏染色为紫色，含大量的细长杆菌、有芽孢的大球菌和梭形菌。 第四代：选择凝固较好的脱脂乳试管，用接种环在无菌条件下将菌种接入BCG培养平板中，接好种后帖上标签进行培养。 培养结果：平板上有的没有长出较好的菌落，且长有杂菌，杂菌的菌落为突起的水泡、灰白色，有的没有染菌，长出较好的菌落。长势较好的菌落4.实验结果及讨论 4.1实验结果 酸奶凝块均匀，乳白色，细腻、絮状、涌出气泡，表面有少量的乳清(清水状液体)，气味清淡，有奶香。 4.2革兰氏染色的注意事项 1.涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察 细菌的形态。 2.染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。 3.染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态。 4.3杂菌污染途径及预防1) 种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。2) 空气带菌。由于实验室的条件有限，只能用酒精灯进行灭菌，灭菌不彻底等引入的细菌会引起染菌。3) 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。4) 设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门