免疫胶体金技术

免疫胶体金技术,Immune colloidal gold technique,胶体金标记技术的相关定义,免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。,胶体金技术的发展Development of Immune colloidal gold technique,1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法,胶体金技术的种类及优点,快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒,免疫层析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动过程中被分析物 与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。,免疫胶体金技术的特点,优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染。GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。,成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）中广为应用的方法。,最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。,不足： 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。,胶体金合成,溶液颜色随金颗粒的大小广泛的变化。通常为深红色。但是也有深棕色/紫色至浅橙色/黄色。胶体的大小由金来控制：柠檬酸盐的比率大约在1到100nm。（？）柠檬酸盐很容易被亲金物质所取代(例如：硫醇),H2AuCl4,H2O, 100OC,胶体金合成程序,将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热,不同大小的颗粒的合成与性质,胶体金颗粒的TEM图像,平均颗粒大小 17nm,优质金颗粒和劣质金颗粒,. 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大,抗体如何被标记于金上,抗体结合于金上取决于三种独立且起独立而又相互依存的力：a在带负电荷的金粒子和带正电的蛋白质间的离子引力。B抗体和金表面的疏水力C巯基(-SH)的影响(半胱氨酸和蛋氨酸）最强的引力可能源于硫键将抗体Fc 段的两个区域进行的连接。,胶体金颗粒带电情况 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）,金标样本程序,将胶体金调整至正确的pH值确定最小蛋白含量最终结合（标记）纯化,为胶体金调整正确的pH值,胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.,蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定,取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH,为胶体金调整正确的pH值,常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值,最小蛋白用量的确定,（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。,（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g45g另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表5-5顺序进行。,量取1ml的胶体金至一系列的3ml的干净塑料管中用100mM的K2CO3或100mMHCl调整抗体至正确的pH值。在每支塑料管中加入从0到150l的一系列抗体（例如：015g的是指在每管中分别加入0，1，2，一直到15g的抗体）摇动每支塑料管并放置约5分钟以便于结合,最终结合（IgG）,取100ml金溶液，调整pH值至9调整滤过和离心的抗体溶液（0.1g/l）至pH9.2当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的抗体5分钟后在金标溶液pH为9时加入10ml滤过的10BSA并轻轻搅拌10分钟在每支管中加入100l，10的NaCl并搅拌1分钟。判断获得最小蛋白量的稳定胶体金溶液,纯化,在浓缩和储存前，金标抗体必须从多余的抗体和小的聚集簇中提纯出来。以合适的速度搅拌金标溶液以获得合适大小的金标粒子。金标记物会以离心管底部的沉淀物形式分离出来，弃去清澈的上清溶液，并用合适的缓冲溶液进行复溶.如果制备方法正确，金标溶液可以在4冰箱内保存数月，如果需长时间保存就需要将其分装成1ml的小包装并增加20的丙三氧基。这样就可以冷冻并在-20冰箱内保存数年。,胶体金免疫层析法试剂的组成,样品垫(Sample pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。 样品垫的作用： 减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布； 去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。,样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。,结合垫(Conjugate pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为： -吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。,硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)： 推荐使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。 NC膜的作用： - 在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数： 孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。,硝酸纤维素膜与蛋白结合的原理 主要有两种假说： 1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。 2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。,硝酸纤维膜的选择,膜的分类标准(m和s) m: 指的是膜孔径， s: 以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是*s. 换算情况大致为：8m=135s；6m=180s 不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.,如何选择物理性能 膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度 厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速； 宽度(检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系跑水性能 注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形