第七章 萃取-双水相萃取ppt课件

第七章双水相萃取 2 3 主要内容 一 概述二 物质在两相中的分配三 双水相萃取工艺流程四 双水相萃取技术的应用五 思考题 4 一 概述 过滤和离心技术 取决于分离颗粒的尺寸或密度差异 难于进行收集微生物的细胞器 分离除去细胞碎片 提取和浓缩胞内物质的操作 萃取已广泛用于液液分离 但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质 1 许多蛋白质有极强的亲水性 不溶于有机溶剂 2 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活 在一定条件下 水相也可形成两相甚至多相 将水溶性的酶 蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能 5 1 最早的双水相萃取现象 1896年Bejerinck 把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合 可分为两相 聚合物之间的 不相溶性 多种不相溶的聚合物可得到多相体系原因 聚合物的空间阻碍作用 相互间无法渗透 聚合物还可以与无机盐可形成聚合物 盐双水相 6 2 优势 7 1 条件温和 保留产物活性 2 含水量高 表面张力低 耗能少 3 大分子及小分子 红霉素 氨基酸等 都可萃取 4 易于放大 8 3 双水相体系形成 聚合物混合时 是分层或成一相 取决于分子间的作用力 分子间作用力 与分子量有关 分子量越大 分间作用力也越大 分子之间作用力 1 A A A B相分离 2 A A A A凝聚复合 9 4 双水相体系类型 两种都是非离子型高聚物 PEG DEX 聚丙二醇 DEX等 PEG polyethyleneglycol聚乙二醇DEX 葡聚糖 其中一种是离子型高聚物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖DEX 两种都是离子型高聚物 羧甲基纤维素钠 羧甲基葡聚糖钠 其中一种是无机盐 磷酸盐 硫酸盐等 PEG 硫酸盐 10 二 物质在两相中的分配 11 2 影响分配的因素 1 双水相中聚合物 组成和浓度 的影响分子量的影响如在PEG Dex双水相体系中 PEG分子量的减少 会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大 12 2 体系中无机盐离子的影响无机盐离子在两相中的分配不同 会导致两上中的电位差 13 如图 当pH6 9时 溶菌酶带正电 卵蛋白带负电 对照上表知 KCl KNa 有电位差 U2 U1 0 导致带正电荷的溶菌酶迁移到1相 其K值增大 而带负电荷的卵蛋白迁移到2相 其K值减少 两者达到较好的分离 14 3 体系pH值的影响蛋白质的离解度 改变蛋白质的电荷 改变分配系数 缓冲物质磷酸盐的离解度 改变电位差 分配系数 pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2 3个数量级 15 4 体系温度的影响温度的变化 分配率 蛋白质的生物活性 聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有保护作用 增加了蛋白质的稳定性 故可在室温一操作 且一般温度变化不大 16 5 体系中微生物的影响影响 上下相体积 胞内蛋白的分配系数 17 三 双水相萃取工艺流程 18 1 双水相系统的选择 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进行分离 对胞内蛋白萃取 使碎片分配于下相中 来增大两相的密度差 达到快速分离 降低操作成本和操作时间 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性 相对分子质量 等电点和表面电荷等性质的差别 来选择萃取目标产物 如调pH 添加盐 提高成相系统的浓度 系线长度 19 双水相萃取过程放大较容易 一般10mL刻度离心管内结果即可直接放大到产业化规模 具体的实验步骤 配制一系列不同浓度 pH值及离子强度的双水相 每个双水相改变一个参数 加入料液后 再加水使整个系统的质量达到5 10g 离心管封口后充分混合 反复倒置或涡旋混合器 在1800 2000g下离心3 5min 分相 分别吸出上下相 测定上 下相中目标产物的浓度或生物活性 计算分配系数 分析目标产物的收率和纯化倍数 确定最佳双水相系统 20 2 相平衡与相分离 相平衡 双水相系统的表面张力很小 相间混合所需能量很低 通过机械搅拌很容易分散成微小液滴 达到相平衡所需时间很短 一般只需几秒钟 相分离 重力沉降 静置分层 或离心沉降法 21 3 多步萃取 22 4 大规模双水相萃取 双水相放大后 溶质的分配系数和相体积比保持不变 溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大 23 四 双水相萃取技术的应用 目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化 1 胞内酶提取 一般是破碎细胞 匀浆液粘度大 碎片很小 离心分离 能耗大 且碎片不易清除干净 双水相萃取 易除去碎片 同时使酶得到精制 目前应用最多的是PEG 盐体系 酶主要分配在上相 碎片在下相或界面上 收率能达到90 料液中湿细胞浓度可达30 分配系数在3 20之间 如下表 24 25 例子 以甲酸脱氢酶 FDH 的分步提取纯化来进一步说明胞内酶的提取 26 27 2 核酸的分离及纯化 特点 盐组成的微小变化引起分配系数的急剧变动 有活性的DNA与无活性的DNA的分配系数差别较大 可通过多级逆流分配平衡将两者几乎完全分开 28 3 人生长激素 干扰素的提取用PEG40006 6 磷酸盐14 体系从大肠杆菌提取 4 病毒的提取 纯化5 生物活性物质的分析检测 29 何谓双水相萃取 在一定条件下 水相可形以成两相 将水溶性的酶 蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相的过程 30 双水相体系可分为那几类 目前常用的体系有那两种 两种都是非离子型高聚物 PEG DEX 聚丙二醇 DEX等 其中一种是离子型高聚物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖DEX 两种都是离子型高聚物 羧甲基纤维素钠 羧甲基葡聚糖钠 其中一种是无机盐 磷酸盐 硫酸盐等 PEG 硫酸盐 31 双水相萃取的优点 1 条件温和 保留产物活性 2 含水量高 表面张力低 耗能少 3 大分子及小分子都可萃取 4 易于放大 32 为什么说蛋白质等生物活性大分子物质不适合用有机溶剂萃取分离而适合用双水相萃取分离 1 许多蛋白质有极强的亲水性 不溶于有机溶剂 2 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活 33 影响双水相萃取的因素有那些 1 双水相中聚合物 组成和浓度 的影 2 体系中无机盐离子的影响 3 体系pH值的影响 4 体系温度的影响 5 体系中微生物的影响 34 用双水相萃取细胞破碎 匀浆 液时 一般是把目标产物分布在上相 而细胞碎片 杂蛋白等杂质分布在下相 为什么 1 核酸等大部分杂质一般处于下相 可以同时除去 2 下相一般是无机盐富集相 作为废弃物扔掉 费用相应低一些 3 将蛋白质产物分配在上相有利于保持其活性 4 碎片在下相有利于连续离心分离 35 选择双水相系统的原则 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进行分离 对胞内蛋白萃取 使碎片分配于下相中 来增大两相的密度差 达到快速分离 降低操作成本和操作时间 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性 相对分子质量 等电点和表面电荷等性质的差别 来选择萃取目标产物 如调pH 添加盐 提高成相系统的浓度 系线长度 36 双水相系统的相平衡需要很长时间吗 不需要 双水相系统的表面张力很小 相间混合所需能量很低