阿维菌素的液相色谱分析

阿维菌素的液相色谱分析 1 阿维菌素介绍 阿维菌素的产生菌 阿维链霉菌 Streptomycesavermitilis 是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的 阿维链霉菌自发现以来 以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究 形成了一个重要的抗生素研究领域 与其他链霉菌一样 阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化 也具有合成多种次级代谢产物的能力 由它产生的阿维菌素在医药 农业及畜牧业上有着重要的商业价值 目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域 2 阿维菌素结构 阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分A1a A21 A2a A2b B1a B1b B2a和B2b 它们的区别主要在于C25 C222 23和C226位所连接的基团不同 3仪器和试剂 高效液相色谱仪 具有紫外可变波长检测器 岛津公司LC 10A色谱数据处理机 CLASS 10A工作站 色谱柱 150mm 3 9mm id 不锈钢柱 内装Nova PakC18 5 m填充物 Waters 过滤器 滤膜孔径约0 45 m 微量进样器 50 L 定量进样管 5 L 超声波清洗器 甲醇 色谱级 水 新蒸二次蒸馏水 乙腈 色谱级 阿维菌素标样 已知阿维菌素 B1a B1b 质量分数 98 0 4 色谱操作条件 流动相 甲醇 乙腈 水 38 38 24 膜过滤 并进行脱气 流量 1 0mL min 柱温 室温 温差变化应不大于2 检测波长 245nm 进样体积 5 L 保留时间 B1a15 6min B1b11 3min 典型阿维菌素乳油高效液相色谱图见图 5 溶液的配制 5 1标样溶液的制备称取阿维菌素标样0 05g 精确至0 0002g 置于100mL容量瓶中 用甲醇溶解并稀释至刻度 摇匀 5 2试样溶液的制备称取含阿维菌素0 05g的试样 精确0 0002g 置于100mL容量瓶中 用甲醇溶解并稀释至刻度 摇匀 6 测定 在上述操作条件下 待仪器稳定后 连续注入数针标样溶液 直至相邻两针阿维菌素峰面积相对变化小于1 5 后 按照标样溶液 试样溶液 试样溶液 标样溶液的顺序进行测定 7 计算 试样中阿维菌素 B1a B1b 的质量分数X1 按式 1 计算式中 A1 两针标样溶液 阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值 A2 两针试样溶液 阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值 m1 标样的质量 g m2 试样的质量 g p 标样中阿维菌素 B1a B1b 的质量分数 8 结果和讨论 8 1线性关系试验在一定质量范围内 按照浓度递增的顺序配制数个已知样 按上述操作条件进行分析 以阿维菌素标样质量为横坐标 峰面积为纵坐标绘制标准曲线 此标准曲线通过原点 计算得回归方程为Y 2 52 108X 4 69 103 线性相关系数r 0 9999 试验证明当阿维菌素浓度在0 004g 100mL 0 2g 100mL之间 进样体积5 L 与其相应的峰面积呈现良好的线性关系 8 2方法精密度试验对阿维菌素原药 乳油按上述操作条件进行多次重复测定 试验表明该定量方法具有较好的精密度 其标准偏差分别为0 32 0 0089 变异系数分别为0 34 1 1 8 3方法准确度试验称取数个已知含量的阿维菌素原药 阿维菌素乳油试样 分别加入一定量的阿维菌素标准品 按本方法测定其中阿维菌素总质量并计算回收率 阿维菌素原药 乳油的平均回收率分别为99 9 100 4 表明该方法具有良好的准确度 8 4最佳操作条件的选择 8 4 1检测波长的确定由阿维菌素的紫外光谱图可以看出 阿维菌素B1a和B1b的最大吸收波长均在245nm附近 由于流动相在该波长处无吸收且对B1a和B1b峰位置无干扰 故检测波长确定为245nm 8 4 2流动相的选择我们首先用单纯的甲醇 水作流动相 结果部分厂家的乳油产品中B1a和杂质峰分离不开 因此又改用乙腈 水作为流动相 但B1a和B1b不能与杂质完全分离 最后尝试用乙腈 甲醇 水作流动相 改变乙腈和甲醇之间的比例 发现当乙腈与甲醇比例小于1时 B1a和杂质不能完全分离 当乙腈与甲醇比例大于1时 B1b和杂质不能完全分离 当乙腈和甲醇比例在1附近时B1a和B1b均能与杂质完全分离 因此确定采用甲醇 乙腈 水 38 38 24为最佳流动相配