细菌实验诊断技术..ppt

第六章细菌实验诊断技术与质量控制 细菌感染的检验 是指样品的采集送检 处理 运用表型和遗传学方法检查病原体的特征作出结果报告的全过程 1 保持检验过程的阶段性 快速性和连续性显微镜检查 分离培养 血清学实验 生化和分子生物学试验 药敏实验等 如能初步鉴定 可分别先后及时向临床提供信息 第一节细菌感染的检验原则 2 根据诊断目的决定鉴定的水平 1 病原学诊断 鉴定到细菌的种 2 指导临床治疗 进行直接或间接药物敏感实验 3 流行病学监控和调查 鉴定到型 4 病原学研究 疗效监控 分子水平的检测 3 了解检验对象的背景 1 病人的背景 2 标本的来源 1 尽早采集一旦怀疑细菌感染 应及时采集标本进行细菌学检验 尽早获得病原学诊断和抗生素敏感资料 对细菌感染的治疗具有极其重要意义 2 标本采集尽量在用药前进行 3 根据可疑病原菌和实验方法的不同选择合适的采集时期 例如 肠伤寒病程第1周采血培养阳性率最高 第2周开始下降 骨髓培养阳性率的趋势和血培养一致但始终高于血培养 且持续至第五周阳性率仍达52 粪便培养阳性率在第2 4周最高 4 重视样品的采集和送检 4 注意无菌操作 尽量避免杂菌污染 5 注意采集的方法和部位 6 标本必须新鲜 及时运送 7 标本的保存 处理要严格 5 必须用纯培养物鉴定 选用单个菌落 1 选择有价值的试验 所选项目大结果可能为阴性 阳性 但阳性 阴性率应大于90 否则无意义 2 选择快速简便的项目 鞭毛染色 氧化酶 凝固酶 触酶 O F等应做为首选项目 3 一种试验有多种方法时 应了解不同试验的敏感性和特异性 6 鉴定实验的选择 第二节细菌感染的检验程序和方法 临床标本 预处理 增菌 接种培养基 分离单个菌落 各种鉴定试验 涂片染色 快速诊断试验 生化试验 血清学实验 涂片染色 药敏试验 动物试验 初步诊断报告 最终诊断报告 一 一般检验程序 2 染色标本染色1 单染色法2 鉴别染色法 复染色法 革兰染色 Gramstain GS 二 形态学检查 涂片染色 1 不染色标本检查悬滴或压迹法 观察活细菌轮廓 动力等 结晶紫1min 卢戈碘1min 95 乙醇30s 稀释复红30s 血液 分泌物 排泄物 穿刺液 脑脊液等标本和液体培养物可直接涂片镜检 有些细菌可做出初步诊断 三 分离培养 一 培养基 1 培养基的种类 2 调整培养基的pH 2 培养基的配制 1 根据组成准确称取 混悬于装有蒸馏水烧瓶中 加热溶解 3 过滤澄清 4 分装5 灭菌6 质量检查7 保存 二 接种与分离技术 1 接种工具1 接种环和接种针是细菌学实验必需的工具 2 接种罩 无菌工作台 无菌室 生物安全柜 2 接种与分离技术 1 平板划线分离 连续划线 放射划线 分区划线 2 斜面的接种 3 半固体和液体培养基的接种 1 温度 37 22 4 42 三 培养条件 2 气体 1 普通培养法2 CO2培养 厌氧手套箱 烛缸 厌氧袋 厌氧罐 3 厌氧培养 CO2培养箱 四 生化试验 1 糖 碳水化合物 分解试验 2 氧化一发酵试验 O F试验 原理 又称Hugh Leifson HL 试验 细菌在分解葡萄糖的过程中 必须以分子氧作为电子受体的 称为氧化型 O 可以进行无氧降解的 称为发酵型 F 此类细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖 不分解葡萄糖的 称为产硷型 利用此试验可区分细菌的代谢类型 F型O型 型 3 甲基红 MR 试验和VP试验 原理 甲基红红色 乙酰甲基甲醇 加入碱 被空气中的氧氧化为丁二酮 培养基pH在6 2以上 加入甲基红呈黄色 VP试验 培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基 葡萄糖 丙酮酸 乳酸 乙酸 甲酸等 培养基的pH下降至4 5以下 与培养基中精氨酸所含的胍基发生反应 生成红色化合物 奈酚加速反应 转化为其它物质 MR试验 原理 氧化酶或称细胞色素氧化酶 是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶 作氧化酶试验时 此酶首先使细胞色素C氧化 然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化 产生颜色反应 方法 取滤纸一角 沾取菌落少许 加试剂一滴 阳性者立即粉红色 并于5 10秒内呈现深紫色 4 氧化酶试验 原理 过氧化氢酶可使过氧化氢分解为分子态氧 方法 滴加3 过氧化氢溶液数滴于玻片上 挑取固体培养基上的菌落少许于过氧化氢溶液 观察结果 结果 30s内产生大量气泡者为阳性 5 过氧化氢酶 触酶 试验 原理 某些细菌能产生尿素酶分解尿素 产氨使培养基变碱 方法 将被检菌接种尿素培养基 35 培养18 24h观察结果 阴性时应继续观察4d 结果 酚红指示剂变红为阳性 不变为阴性 6 尿素酶试验 原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸 生成吲哚 吲哚与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用 生成玫瑰吲哚而呈红色 方法 挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基 于35 培养1 2d 沿管壁徐徐加入吲哚试剂少许 使成两层 观察结果 结果 两者液面接触处出现红色为阳性 无色为阴性 7 吲哚试验 原理 当细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时 可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸钠 使培养基变碱 方法 在枸橼酸盐琼脂斜面上浓密划线 接种被检菌 于35 培养1 4d 逐日观察结果 结果 枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长 培养基变蓝为阳性 无细菌生长 颜色不变 绿色 为阴性 8 枸橼酸盐利用试验 五 免疫学试验 人体受致病菌感染 免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体 抗体的量常随感染过程而增多 表现为效价 滴度 的升高 因此 用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化 可作为某些传染病的辅助诊断 一般采取病人的血清进行试验 故称为血清学诊断 血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本 当后者的抗体效价比前者升高大于等于4倍时方有意义 常用方法 直接凝集试验 乳胶凝集试验 沉淀试验 补体结合试验 中和试验 ELISA 一 血清学诊断 serologicaldiagnosis 以细菌的菌体成分为待测抗原 用特异性的抗体进行检测 用于细菌的分型或鉴定常用方法 1 凝集试验2 荚膜肿胀试验3 免疫荧光技术 二 免疫学鉴定 六 药物敏感试验 七 分子生物学试验1 核酸杂交2 核酸扩增技术 PCR RFLP SSCP等 3 基因芯片 蛋白质芯片 八 微生物商品化及自动化检测和鉴定系统 API数码鉴定系统 VITECK全自动细菌鉴定系统 血标本培养系统 第三节实验室质量控制 一 室内质量控制是由实验室内部制定并实施的 是质量保证的核心和基础二 室间质量控制评价是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价