细胞工程ppt课件

.,1,细胞工程CELLENGINEERING,改造和培养细胞、组织、器官、个体的工程,刘广发,.,2,细胞工程主要内容（1）,细胞工程的基础知识与基本技术；植物组织培养；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；花药及单倍体植株培养；原生质体制备与细胞融合；人工种子制备；植物脱病毒技术；,.,3,细胞工程主要内容（2）,动物细胞与组织培养动物细胞融合细胞重构与动物克隆淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体染色体转移与基因转移人类干细胞研究原核细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合,.,4,参考文献,自编.细胞工程讲义罗立新等.细胞工程.华南理工大学出版社，2003李志勇编著.细胞工程.科学出版社，2003,.,5,探究式自主学习计划,自愿组成学习小组，3人左右，选出组长；每组选一个主题，时间约10min；各组需准备PowerPoint;各组最高可得8分；其他同学可提问、补充或更正；教师讲评和讨论；,.,6,探究式自主学习安排（已选）,.,7,探究式自主学习安排（2）,.,8,细胞工程的三个层次,细胞水平：细胞培养,细胞融合，整株培养；细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞器；基因水平：基因转化；,.,9,开展细胞工程的意义,研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点；有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品种的步伐；可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物；有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产；可获得脱毒植物；,.,10,第一章细胞工程发展简史,一.植物细胞工程1902德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具全能性；1904德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成植株；1922Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根；1930-34李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长；1934美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；,.,11,植物细胞工程,1935-36中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长；1937美国White发现VitB促进离体根生长，指出IAA能调控生长；1937美国Michel首创用0.5MNaNO3融合两个植物细胞原生质体；1941Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚；？Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；,.,12,植物细胞工程,1956Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍；1958Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株；1953Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养；1960英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体；1964印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织；1968Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；,.,13,植物细胞工程,1972Carlson用NaNO3成功融合不同烟草的原生质体；1977Kao（高国南）首创PEG-高钙高pH值细胞融合法；1978Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物；1985Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、日本和法国相继开展人工种子研制；,.,14,二.动物细胞工程,1885Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天；1903Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月；1907美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长出轴突；1914Tomson创立能在培养基中维持器官小块的方法；？Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限生长；,.,15,动物细胞工程,1940Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系；1951Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系；1958冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合；1960s童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；,.,16,动物细胞工程,1960Barski成功进行小鼠细胞融合实验；1965Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞；1967Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失；1975Kohler吲哚丁酸（IBA）,常用15mg/L；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-510-7mol/L;萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L；,.,34,细胞分裂素类激素,激动素（KT）6-苄氨基嘌呤（6-BA）玉米素,先加少量碱液预溶,.,35,继代增殖阶段,移植扩增；分割继代；,.,36,光照培养室,.,37,生根长芽阶段,生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用；外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；,.,38,长芽生根阶段,.,39,移栽成活阶段,保湿是关键；避免强光直射；温度适宜；,.,40,植物组培的优缺点,优点：ABCD缺点：ABC,.,41,手指玫瑰,.,42,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,本方法的历史、现状1956年，Routier1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”；1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L；目前世界最大的细胞培养罐达20t；,.,43,红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物,.,44,细胞培养和原植物的天然产物量的比较,产量物种天然产物细胞培养原植物橘叶鸡眼藤蒽醌900微克/克干重110微克/克干重决明蒽醌鲜重的0.334%种子干重的0.21%长春花蛇根碱干重的1.3%干重的0.26%三角叶薯蓣薯蓣皂苷26mg/克干重20mg/克干块根人参人参皂角苷鲜重的0.38%鲜重的0.33.3%烟草烟碱干重的3.4%干重的25%烟草泛醌0.5mg/克干重16mg/克干叶大红罂粟蒂巴因130mg/克干重140mg/克干叶,.,45,从植物培养细胞中获得的各类物质,氨基酸核酸蛋白质碳水化合物脂类维生素有机酸抗白血病药抗肿瘤药抗病毒药抗微生物药酶抑制剂色素香料甜味剂鸦片杀虫剂激素强心苷核苷酸橡胶阿司匹林奎宁可卡因,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,46,培养植物细胞制造疫苗,2006年2月，美国DowAgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗；将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。,.,47,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,悬浮培养1.成批培养（封闭式培养）优点：易于操作；次生代谢物含量高；缺点：效率低；2.半连续和连续培养,.,48,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,固定化细胞培养次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性；细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于回收次生代谢物；,.,49,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,平床培养系统优点：制作简单；能生产较多次生代谢物；缺点：占地面积大；分化区比例较小；02供应受限；,.,50,包埋法固定细胞,将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。凝胶包埋法固定化（gelimmobilization)海藻酸盐（alginate)-角叉胶（-carrageenan)琼脂糖（agarose)琼脂（agar)聚丙烯酰胺（polyacrylamide)壳聚糖（chitosan)白明胶（gelatin),.,51,微胶囊法,微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球囊，培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过，细胞不能通过，使囊内成为一个微小环境。,.,52,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,立柱培养系统1.细胞固定化琼脂固定细胞,.,53,褐藻酸钙固定细胞无菌大量培养植物细胞等量混合注入尼龙网配制4%褐藻酸钠，灭菌氯化钙溶液（2%）浸浴褐藻酸钙固定的细胞团,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,54,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,立柱培养系统优点：占地面积小次生代谢物产量高缺点：制作较复杂O2供应受限,.,55,立柱培养系统操作要素：取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供应；某些种的细胞培养需光照；尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,56,提高次生代谢物产量的途径生物种性：1.选择高产的品系或细胞系；目测法，化学分析法，外因选择法；2.诱变筛选高产细胞系：化学法，物理法；3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系；,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,57,提高次生代谢物产量的途径培养条件:1.培养基：A碳源：常用蔗糖，但应因种摸索；B氮源：常用NO3-和NH4+，（或单用或兼用）；C生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生产具极大影响；D供给目的产物的直接或近直接前体物质；,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,58,提高次生代谢物产量的途径培养条件:2.物理因子：A光质和光量（适量光照）；B温度：2530；C通气：底部通气好；DpH值：56,第二节植物细胞培养和次生代谢物生产,.,59,第三节植物原生质体制备与融合,原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细胞；亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）；微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体；原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细胞壁的原生质体；,几个名词：,.,60,植物原生质体研究的意义,有利于进行远缘杂交；有利于引入生物大分子、细胞器等；有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；,.,61,植物原生质体的制备(1),机械法：高渗处理植物（外植体，愈伤组织，液培细胞）质壁分离机械切割原生质体（亚原生质体）缺点：难，少，分生组织不宜；,.,62,酶解法1.酶的购置与纯化市售的纤维素酶一般都是复合酶，含：纤维素酶C1；纤维素酶Cx；纤维二糖酶；果胶酶；磷脂酶；核酸酶；过氧化物酶；酚类；此外，还有蜗牛酶；,植物原生质体的制备(2),最好应纯化,.,63,酶解法2.取材：干净，高活性A幼嫩的根、茎、叶；B悬浮培养的细胞和体细胞胚；无需灭菌，最好同步化；C花粉母细胞和四分体；分生能力强，应使用蜗牛酶；,植物原生质体的制备(3),.,64,外植体除菌：外植体肥皂水洗清水洗酒精（75%，10s）次氯酸钠（3%，15min）无菌水洗34次无菌滤纸吸干,植物原生质体的制备(4),.,65,外植体酶解除菌后叶片撕去下表皮切块放入反应液2530不时轻摇反应液转绿24h,植物原生质体的制备(5),.,66,外植体酶解缓冲液：pH值5.55.8渗透压稳定剂：糖、甘露醇、山梨醇等膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸钾（0.3%）表面活性剂：Tween80适当时间适当温度,植物原生质体的制备(6),.,67,原生质体分离过滤法离心法（低速）漂浮法（不同比重）,植物原生质体的制备(7),.,68,原生质体洗涤以新的渗透压稳定剂或培养液轻轻洗涤24次;,植物原生质体的制备(8),.,69,原生质体鉴定1.直接镜检：球形，低渗破裂，荧光增白剂(UV下细胞壁显绿色荧光）2.活力测定：双醋酸荧光素（FDA）染色法：FDA进入细胞，被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能进入死细胞；台盼蓝染色：台盼蓝不能进入活细胞；胞质环流观察；,植物原生质体的制备(9),.,70,植物原生质体的培养基,无机成分:KNO3725;CaCl22H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2EDTA37.3;Fe2SO47H2O27.8;H3BO43.0;MnSO44H2O10.0;ZnSO47H2O2.0;KI0.75;Na2MoO42H2O0.25;CoCl26H2O0.025;CuSO45H2O0.025糖类：(mg/L)葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250；甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇250；纤维二糖250；维生素：(mg/L)维生素C2.0；维生素B11.0；维生素B61.0；氢化胆碱1.0；对氨基苯甲酸0.02；叶酸0.4；生物素0.01；维生素A0.01；维生素D30.01；维生素B120.01；生长调节物：酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0.5；2,4-D0.2；有机酸：柠檬酸40；苹果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸钠20；,V-KM培养基(mg/L),.,71,植物原生质体再生培养方法（1）,固体平皿培养法原生质体悬液2ml小培养皿MS培养基配制的1.2%agar2ml（2528，置大皿内（预加湿滤纸）腊带封口培养100300lux，12hd-1)分化培养基愈伤组织成苗,摇匀冷却,.,72,固体平皿培养法优点：便于定点观察原生质体不易破裂缺点：通气较差原生质体与琼脂混合不易掌握原生质体过于分散,植物原生质体再生培养方法（1）,.,73,液体培养法原生质体置液体培养基中培养，不时轻摇，能较快生长。细胞团形成后应移到固体培养基中才能继续生长或诱导分化成苗。缺点：原生质体易受损通气较差操作较麻烦,植物原生质体再生培养方法（2）,.,74,液体浅层培养法（液-固法）营养琼脂培养基（0.6%）小皿凝固放置无菌滤纸注入3mL原生质体悬浮液放大皿内（垫湿滤纸）封口保温，光照（或不光照）轻摇愈伤组织分化培养基成苗,植物原生质体再生培养方法（3）,.,75,液体浅层培养法（液-固法）优点：通气好营养均匀生长较快缺点：需定期添加培养基不易更换培养基,植物原生质体再生培养方法（3）,.,76,小块液培法原生质体悬浮液琼脂糖（0.8%）切小块置液体培养基中80100rpm，2528愈伤组织移放分化培养基成苗,植物原生质体再生培养方法（4）,混匀倒平皿凝固,.,77,小块液培法优点：缺点：,植物原生质体再生培养方法（4）,.,78,固体活性炭培养基琼脂培养基+1%活性炭原生质体悬浮液平皿培养成苗,植物原生质体再生培养方法（5）,混匀凝固,优点：缺点：,.,79,混合培养（液体或固体培养基）将两种原生质体混合培养有何意义？,植物原生质体再生培养方法（6）,.,80,植物原生质体融合回顾,1909Kuster把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中，见质壁分离的亚原生质体，复原时观察到亚原生质体的融合；1931Plower用针插入原生质体，使质膜和液泡膜融合；1937Michels观察到同种和不同种原生质体的融合；1960Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体；1970Power用NaNO3使燕麦和玉米的原生质体融合；1971Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株；1972Carlson首次经原生质体融合获得种间杂种烟草；1973Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合；1974Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合；1977Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合；1978Melchers获得属间杂种（番茄马铃薯）；1979Senda提出电激法融合原生质体；1987斯维格将电融合与微培养结合；,.,81,化学法诱导融合（无菌操作）按一定比例混合双亲原生质体悬液；吸一份混合液于表面皿上，静置10min；滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，轻轻摇匀；PEG溶液组成：PEG50%（MW=15606000)glucose0.1mol/LCaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol/LpH5.5,植物原生质体融合（1）,.,82,植物原生质体融合（2）,化学法诱导融合(续前）25保温1545min，不时轻摇；滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；高钙高pH溶液组成：glycine50mmol/LCaCl250mmol/Lglucose300mmol/LpH10.51015min后，再滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；1015min后，再加12mL原生质体培养液，摇匀；用20mL原生质体培养液洗5次，间隔5min；加0.5mL原生质体培养液，微滴培养；,.,83,物理法诱导融合微电极法两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质体表面接触，用512A的电流刺激15毫秒，促成融合。平行电极法相距200m的微电极插入原生质体溶液中，先通入交变电场，使其紧密接触成串珠状；再施以适当电脉冲，原生质体接触区发生可逆击穿而融合；,植物原生质体融合（3）,.,84,不对等细胞融合（灭活一方原生质体）,植物原生质体融合（4）,.,85,原生质体融合后的产物,亲和杂种细胞（难）部分亲和的杂种细胞含双方胞质及一方核含双方胞质及一方核和少量它方染色体（细胞周期短或继代次数少的一方，染色体易保留）3.异核质杂种（少）4.嵌合植株,.,86,融和体的鉴别,细胞鉴别细胞大小色素有无细胞核大小荧光鉴别植株鉴别形态特征染色体显带同功酶法、过氧化物酶法分子杂交法RFLP法RAPD法,.,87,杂种细胞筛选,显微操作法要有：可识别标志显微操作仪能培养单个原生质体的培养基遗传互补法要有具突变标记的品种1.白化互补法2.生长互补法3.抗性互补法4.代谢互补法,.,88,西红柿与马铃薯杂交研究进展,1971年，Power提出设想1978年，Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株1983年，Shepard亦融合成功亟待解决的问题：1.哪些基因和条件决定果实与块茎的形成2.光合作用产物的运输方向与分配3.光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需要1994年,Schoenmakers继续本研究1995年，Wolters还在研究,.,89,第四节单倍体植物的诱发与利用,一.单倍体植物的特点：株矮，叶、花、果小，生活力弱；高度不育；？,.,90,二.单倍体植物的利用：可加快培育新品种；有利于突变体的选择与利用；？,第四节单倍体植物的诱发与利用（2）,.,91,三.诱导产生单倍体植株的途径：(一）自然发生1.孤雌生殖2.孤雄生殖3.无融合生殖,第四节单倍体植物的诱发与利用（3）,.,92,三.诱导产生单倍体植株的途径：(二）人工诱导：1.花药培养：1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗；1.2花药预处理；1.3选择适当的培养基与培养条件：1.3.1只需简单培养基；1.3.2培养基尚需添加激素；1.3.3培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺；,第四节单倍体植物的诱发与利用（4）,.,93,1.4培养条件：降低气压；纯N2密闭处理3060min，或掺入O22.55.0%；0.5mol/L甘露醇处理2天；花药平放；适当密植；,第四节单倍体植物的诱发与利用（5）,.,94,1.5花药单倍体植株的形成途径：1.5.1生殖细胞退化，由营养细胞分裂产生；（常见）1.5.2小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞，直接分裂、分化长成；（常见）1.5.3营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚的形成；1.5.4仅由生殖细胞分裂形成；,第四节单倍体植物的诱发与利用（6）,.,95,2.离体花粉培养挤压法分离花粉；自然散开法分离花粉；3.未授粉子房或胚珠的培养4.杂交法获单倍体植株,第四节单倍体植物的诱发与利用（7）,.,96,5.单倍体植物的加倍用秋水仙素（0.20.4%）处理2448h；加倍方式？,第四节单倍体植物的诱发与利用（8）,.,97,Section5.ResearchesonArtificialSeeds人工种子的研制（1）,人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其它成分的人工胶囊；人工种子的构成：胚状体：由组织培养或细胞培养产生；人工胚乳：营养物质+激素+农药+抗生素+除草剂等；人工种皮：抗压，保水，透气；,.,98,Charactersofartificialseeds：不受环境因素制约,一年四季进行工厂化生产；有利于保存该种系的优良性状；成本低，适合于机械化播种；可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（2）,.,99,Thesynchronousgrowthofembryoid胚状体的同步化生长：低温法抑制剂法分离法：分离胚性细胞团；通气法：通入N2或乙烯；渗透压法？,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（3）,.,100,Preparationforartificialendosperm人工胚乳的制备：MS培养基+淀粉水解物+激素+抗生素+农药+除草剂等；Anyoneelse？,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（4）,.,101,Embedmentofartificialseeds人工种子的包埋（滴注法）胚状体褐藻酸钠（终浓4%）混匀合成胚乳,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（5）,还有其他方法？,1015min,CaCl2（2.02.5%）,圆形胶囊,无菌水漂洗,捞起,Elvax4260处理干燥,圆形人工种子,.,102,人工种子的直径由决定；人工种子内含胚状体数目取决于；人工种皮的厚度因而定；,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（6）,.,103,人工种子的干燥：自然干燥人工干燥：222,相对湿度705%46d;胚状体由玻璃状转为不透明表示发育成熟。,Section5.ResearchesonArtificialSeeds（7）,干燥的目的？,.,104,病毒对植物的危害植物哪些部位可能没病毒或较少病毒？植物哪些器官或部位无维管束（或维管束不发达）？切割外植体时是大些还是小些比较可能获得无毒组织块？组织块大些还是小些比较容易获得愈伤组织？,第六节植物脱病毒技术（1）,.,105,脱除不同病毒时所取的茎尖大小一样吗？茎尖很小，实验时应注意哪些问题？为什么有人喜欢用花瓣来脱病毒？哪些外因能被用于脱除病毒？通过培养愈伤组织能脱毒吗？Why？哪些途径可使脱毒植株不再染毒？,第六节植物脱病毒技术（2）,.,106,第六节植物脱病毒技术（3）,茎尖脱毒1.茎尖培养：茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过2万个细胞，或至少310mg茎尖。2.花瓣培养3.花药培养,.,107,植物脱毒检测（4）,电镜法免疫血清法离心去渣植物组织匀浆上清液纯化病毒待检植物匀浆上清液动物免疫抗血清（抗体）免疫检测,.,108,植物脱病毒进展（5）,脱毒马铃薯（青海）染有病毒的普通马铃薯亩产约1吨，脱病毒的马铃薯亩产达4吨；全国年种马铃薯3400万公顷；脱毒草莓红宝石色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢；脱毒唐菖蒲长势旺盛，花色艳丽，品质提高12个等级；脱毒水仙,.,109,Chapter3.AnimalCellEngineering第三章动物细胞工程,Themaincontent：动物细胞与组织培养;动物细胞融合;动物细胞核移植与胚胎克隆;淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体;染色体转移与基因转移;,.,110,Section1.CultivationofAnimalCellsandTissues第一节动物细胞与组织培养,细胞培养：细胞在体外条件下的保存和生长，在培养过程中不形成组织；组织培养：组织在体外条件下的保存和生长，继续保持组织的结构和功能；器官培养：器官的胚芽、整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存和生长，可有器官的分化，并保持器官的立体结构和功能；,.,111,细胞系（Cellline)原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括：有限细胞系和连续细胞系；细胞株（Cellstrain)通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物；,.,112,一.细胞培养,Section1.Cultivationofanimalcellsandtissues第一节动物细胞组织培养,制备动物细胞：,培养液漂洗切割解离液无菌取出目的组织无菌组织小组织块细胞移放培养瓶,抗生素漂洗,离心洗涤,.,113,动物细胞培养,.,114,Quantitativecultivationofmammalcells二.大量培养哺乳动物细胞,微导管法以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液；微载体法葡萄糖等聚合物形成直径50500m的微球悬浮培养液中细胞贴附生长微胶囊法细胞与褐藻酸钠混合液滴入CaCl2中褐藻酸钙胶囊悬浮培养,.,115,动物细胞培养器,.,116,Tissuescultivation三.组织培养,动物表面消毒获组织小组织块,鸡胚心肌组织如何培养？,无菌刀切,加培养液,吸放培养瓶,静置培养（37）,组织块长大,传代,众多组织块,培养液、抗生素漂洗,解剖,.,117,Generationofthecultivatedcell四.培养细胞的传代,胰酶EDTA离心培养细胞贴壁细胞游离弃上清加新培养液分瓶细胞沉淀悬浮细胞,培养,.,118,Non-serumcultivation五.无血清培养,血清培养的缺点：成分不确定，批次有差异，容易受污染，价格较昂贵；无血清培养基的组成：基础培养基：常用DME与F12培养基等量混合；基质：纤粘素，血清铺展因子，胎球蛋白，多聚赖氨酸，胶原；生长因子、维生素和激素等约30余种微量有机和无机物；,.,119,六.无血清培养基常用生长因子与激素,胰高血糖素神经生长因子胰岛素甲状腺释放激素前列腺素E2a表皮生长因子成纤维细胞生长因子前列腺素E1生长激素黄体化激素释放激素黄体化激素甲状旁腺激素转铁蛋白母羊因子氢化考的松SometomedinC无脂肪酸牛血清白蛋白雌二醇孕酮促卵泡刺激因子睾酮三碘甲状腺氨酸亚油酸维生素A醇-生育酚维生素C腐胺CdSO4H2SeO3,.,120,Keepfreefrombiologicalcontamination七.防治污染(1),微生物污染：细菌污染；真菌污染；支原体污染；病毒污染其它细胞污染；,.,121,Keepfreefrombiologicalcontamination七.防治污染(2),污染来源：不洁动物标本；空气：操作室与超净台的过滤设备老化；器械灭菌不彻底；人员操作；血清；,.,122,Keepfreefrombiologicalcontamination七.防治污染(3),污染物鉴别：肉眼观察；光学显微镜观察；电子显微镜观察；特殊培养观察：支原体,.,123,Keepfreefrombiologicalcontamination七.防治污染,污染源治理细菌青霉素（200umL-1),链霉素（200gmL-1)真菌制霉菌素（100umL-1)支原体卡那霉素（100gmL-1，不能根除)病毒？其它细胞1.同一工作面不能有其它细胞系存在；2.两种细胞系不能共用培养器具；,.,124,Long-termconservationofcellculture八.细胞培养物的长期保存,传代法：Carrel使鸡胚心细胞传3400次，34年;液氮法：培养细胞甘油/二甲亚砜（510%）,混匀,安瓿封装,细胞/安瓿,降温至-30（13/min）,降温至-150（1530/min）,置液氮（-196）中,低温保存细胞,.,125,AnabiosisofCell细胞复苏,取出安瓿，投入37水浴，轻摇，重新形成细胞悬液（注意防护）,.,126,Section2FusionofAnimalCells第二节动物细胞融合,1958年，日本冈田善雄意外发现经UV灭活的仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合；1960年，法国Barski发现两种不同类型细胞混合培养会自发形成融合细胞；1965年，冈田善雄等采用灭活的仙台病毒融合产生第一个动物种间异核体；1966年，Yerganian用相同的方法获得能增殖的杂种细胞；,.,127,AnimalCellFusionInducedbyVirus病毒诱导融合,双亲本细胞灭活仙台病毒（疱疹病毒，副黏液病毒）细胞沉淀细胞凝集各种融合子,混匀，冰浴20min，稍摇,37,30min,洗涤,选择培养基,所需的融合子,分别制悬液,混合离心,.,128,CellFusionInducedbyChemicals化学诱导融合,1974年，高国南发现PEG能诱导植物细胞原生质体融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合动物细胞成功；悬浮法PEG40004050%，处理12min;离心法PEG10003040%，离心58min;(可加515%二甲亚砜）,.,129,电激诱导融合,与植物原生质体相同,.,130,ScreeningHybridCells杂种细胞筛选,抗药筛选营养缺陷筛选,.,131,ApplicationofCellFusion细胞融合的应用,基因定位;体细胞杂种致瘤性分析;遗传缺陷的基因互补研究;分化功能表达调控;,.,132,Section3Monoclonalantibodyproducedbylymphocytehybridoma第三节淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体,抗原记忆细胞B淋巴细胞（脾）浆细胞特异抗体融和小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤细胞,2002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,特异抗体,产生,产生,筛选,.,133,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术示意图,.,134,Screenofhybridoma杂交瘤细胞的筛选(1),HGPRT基因缺陷的肿瘤细胞不能在含HAT的选择培养基上生长；B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外生长。利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。,HGPRT:次黄嘌呤核糖磷酸转移酶HAT：次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶,.,135,Screenofhybridoma杂交瘤细胞的筛选(2),如何获得融和细胞？如何得到单个融和细胞？鉴别是否分泌所需抗体；融和细胞的遗传稳定性；,.,136,Section4CellReconstruction世界各国普遍反对克隆人;,.,166,克隆技术应该应用于哪些领域新浪网调查,1克隆濒临灭绝的动物66.32%;2克隆人类部分器官用于医疗62.11%;3克隆国家保护的动物27.37%;4创造新的物种17.89%;5克隆可食用的动物11.58%;6克隆人类用于生活7.37%;7其它5.26%,.,167,坚持克隆人的3位科学家,意大利医生安蒂诺里Antinori,美国医生扎沃斯Zavos,邪教组织“雷利安运动”的法国科学家布瓦瑟利耶BrigitteBoisselier,.,168,Cloneofhumanembryo克隆人类胚胎,英国政府2004年8月向纽卡斯尔大学颁发了世界上第一份克隆人类胚胎的合法执照，批准这所大学进行以医疗为目的的克隆人类胚胎研究。,.,169,Section5ChromosomeTransfer第五节染色体转移,微细胞（微核体）介导微细胞(minicell)：只含有一至几条染色体、少量细胞质和完整质膜的核质体。优点：简化供体；受体细胞受影响小；染色体很少损坏或不损坏；,.,170,Preparationforminicells微细胞制备,秋水仙素0.1g/mL，816h细胞松弛素B1g/mL，46h供体细胞培养中期细胞大小细胞悬液12000g，10min细胞松弛素B10g/mL，0.51h39000g,20min含微细胞上清液微细胞无血清培养基悬浮滤膜过滤微细胞微细胞沉淀线性梯度BSA悬浮分别离心微细胞,.,171,Fusionbetweenminicellsandacceptedcells微细胞与受体细胞融合,微细胞（百万个）含植物凝集素P的无血清培养基悬浮液受体细胞1015min，37凝集吸去植物凝集素P加PEG1540（3050%）1min吸去PEG液无血清培养基洗涤3次1624h，37加完全培养基胰酶消化，收获离散细胞分装培养瓶选择培养基筛选,.,172,DirectlyChromosomeTransfer直接转移染色体,细胞同步化与染色体分离秋水仙素处理胰酶处理离心供体细胞4，20min细胞沉淀缓冲液洗涤破坏有丝分裂器37，10min4，3000rpm,10min针筒喷射细胞破碎液密度梯度离心染色体分离大小染色体流式细胞仪,.,173,ChromosomeTransfer染色体转移,显微注射法细胞直接吞噬法染色体-磷酸钙共沉淀法染色体悬液与CaCl2（2mol/L）按16：1混匀滴入受体细胞20min37,4h,CO2培育箱加入完全培养基（20mL)加二甲亚砜（30%）10mL30s加10mL新培养液吸去培养液胰酶消化收获细胞选择培养基,.,174,Lipidsomepacking脂质体包装法,乙醚-氯仿-染色体悬液2mL37旋转蒸发卵磷脂-胆固醇混合液100000g,30min弃上清染色体悬液，培养液脂质体悬液脂质体沉淀混悬液滴加2h受体细胞加PEG吸去各液体24h加新鲜培养液选择培养基,混合,.,175,乙醚：氯仿=1：1,107条染色体mL-1,乙醚-氯仿染色体悬液配方：,.,176,Prescriptionforchromosomesuspension染色体悬液配方,NaCl8.0gKCl0.2gK2HPO41.15gKH2PO40.2g无菌水定容1000mL,.,177,Section6ResearchonHumanStemCell第六节人干细胞研究,干细胞是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。,.,178,EngineeringofStemCell干细胞工程,上世纪五十年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞（EmbryonicStemCell,ESC），从此开创了干细胞生物学研究的历程。1970年，MartinEvans分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的细胞使之长成皮肤、骨胳和软骨，甚至是重要器官的一部分，这类细胞就是干细胞。1997年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。,.,179,全能性干细胞（胚胎干细胞）；多能性干细胞；专一性干细胞；,TypesofStemCells干细胞的类型,.,180,TypesofStemCells（1）,全能性干细胞：即受精卵及胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部206种组织和细胞甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。,.,181,TypesofStemCells（2）,多能性干细胞：这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其它细胞。（这种观点已受到质疑）,.,182,DifferentiationofHematopoieticStemCell造血干细胞分化,.,183,TypesofStemCells（3）,专一性干细胞：这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。（这种观点已受到质疑）,.,184,CharactersofStemCell,具有分裂成其它细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。,.,185,ThreeStepsontheResearchofStemCell,获得干细胞系;建立干细胞诱导分化模型;将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,.,186,ThreeStepsontheResearchofStemCell（1）,获得干细胞系：这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传25代以上）；,.,187,ThreeStepsontheResearchofStemCell（2）,建立干细胞诱导分化模型：可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造），探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学或/和物理条件；,.,188,ThreeStepsontheResearchofStemCell（3）,将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。,.,189,TherapyComparisonbetweenTraditionalandStemCell,低毒性（或无毒性），一次治疗有效;不需要完全了解疾病发病的确切机理;用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应；,.,190,ArguewithStemCell,EmbryoStemCell;SomaticStemCell;,.,191,坑人？救人？,英国2000年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究；美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行研究；德国只允许研究2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其它可选择的情况下才能进行。,.,192,中国支持治疗性克隆研究,中科院副院长陈竺院士2002年7月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如14天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意义上的人。人类干细胞研究给21世纪医学的革命性发展带来可能，因此总的平衡利弊，还是要支持”。陈竺副院长还强调，在支持的同时还要有严厉的法律、法规来保证这样的技术发展能真正造福人类。,.,193,前程无量的干细胞工程,干细胞巨大的潜在应用价值引起世界许多国家和机构的高度重视，他们投入巨资进行研究，陆续取得了一系列重大的发现，导致1999年12月美国科学杂志将人类干细胞的研究评为当年十大科学成就之首。,.,194,干细胞器官工程的难点,地球重力限制了细胞的三维生长；离体培养难以确保器官形成所需的多种条件；细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；,.,195,国际领先的徐荣祥,2002年08月:5年内克隆人体所有器官,.,196,国际领先的徐荣祥,我国徐荣祥教授在皮肤干细胞原位再生方面取得了原创性的重大突破。他们对被烧伤的皮肤进行适当处理后，成功地直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复。该技术显示我国干细胞研究已率先进入组织和器官的原位干细胞修复和复制阶段，在国际上处于领先地位。,.,197,干细胞研究进展（1）,1998年Wisconsin大学的JamesThomson和JohnsHopkins大学的JohnGearhart首次从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞，在体外可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。1999年Goodell等将小鼠肌肉干细胞体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死剂量辐射的小鼠中，肌肉干细胞会分化为各种血细胞。,.,198,干细胞研究进展（2）,2000年8月日本筑波大学把鼠肝干细胞体外培养后移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干细胞发育成新的肝组织，分泌出鼠肝特异清蛋白。2001年1月浙江大学药学院副院长楼宜嘉教授等通过药物诱导在体外将胚胎干细胞定向分化成心肌细胞，能搏动。2001年8月中国西北农林科技大学窦忠英等从人胚胎干细胞分化得到能跳动的类心肌细胞。,.,199,干细胞研究进展（3）,2001年11月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司JoseCibelli等用化学药物处理77枚猴子的卵，其中4枚单性发育到囊胚期，从中分离出干细胞，诱导它们形成神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和脂肪细胞等，从而有助于跨越伦理道德的障碍。2001年12月美国人种起源研究所把人胎盘干细胞转化成神经细胞、血细胞、软骨细胞、皮肤细胞、肌细胞。,.,200,干细胞研究进展（4）,2002年2月日本京都大学再生医学科学研究所用鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞，并将它们转移到3只患糖尿病的实验鼠内，一周后实验鼠的血糖值都正常。2002年2月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司从母牛耳朵取皮肤细胞的细胞核，与去核卵电激融合，形成早期胚胎。取出其中的胚胎干细胞，放在肾形可降解“支架”上生长，获得外形和功能都似牛肾的微型器官，可泌尿，存活数月，不被排斥。,.,201,干细胞研究进展（5）,2002年3月剑桥大学乔治戴利和鲁道夫耶尼施等对鼠胚干细胞的免疫缺陷基因进行修复后，再将其植入鼠体，结果修复了鼠的免疫系统缺陷。2002年3月美国麻省理工学院罗伯特兰格等利用人胚干细胞培育出可能形成血管的组织，将它们注入免疫抑制的鼠中，未受排斥，14天后形成毛细血管网。2002年4月美国医生从病人的骨髓中抽取干细胞将其植入他的脑中，患者的帕金森综合症明显好转。,.,202,干细胞研究进展（6）,2002年6月澳大利亚的莫纳什大学研究人员在世界上首次利用人干细胞培育出完整的功能齐全的胸腺。2002年6月日本三菱化学生命科学研究所桥本有弘等将人体肌肉干细胞诱导长成骨细胞和脂肪细胞。2002年7月美国的弗里德兰德等将实验鼠骨髓的“内皮祖细胞”注入鼠眼，后者会附着在视网膜内的星形细胞上，与原有血管相结合形成新血管。,.,203,干细胞研究进展（7）,2002年9月美国波士顿弗西斯研究中心从小猪体内提取牙齿干细胞，用酶催化后，放入可降解牙模中，再植入小鼠腹部。在30周内，这些细胞长成包含珐琅质和牙质的牙冠。2002年10月中国河北农业大学桑润滋教授等在国内首次分离出山羊早期胚胎的类胚胎干细胞和类生殖细胞，经培养、分化试验，获得了类神经细胞和上皮细胞。,.,204,干细胞研究进展（8）,2002年10月广州中山大学附属第二医院黄绍良教授等在国内首次建立三个中国人胚胎干细胞系CHE1、CHE2和CHE3，并采用分阶段方法成功诱导小鼠胚胎干细胞发育成造血干细胞。2002年10月韩国与美国的科学家把干细胞置于可被吸收的生化塑料小架子上，再放到受中风严重破坏的老鼠脑部。一个月之内，干细胞形成了新的脑部组织，还刺激原有的脑细胞生长。受损的部位已经大部分恢复。,.,20