VFA测定步骤与方法.doc

挥发性脂肪酸的测定一、GC（Gas chromatograph）工作条件仪器： GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司）毛细柱：NUKOLTM Capillary Column ( Supelco )；Column No.34292-07B 30m0.32mm0.25m film thickness气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130，汽化温度180，采用氢离子火焰检测器，检测温度180，载气为氮气，压力为60 KPa，氢气压力为50 KPa，氧气压力50 KPa，灵敏度（档）为101，衰减3.0二、样品制备1试剂制备（1）配制25%w/v 的偏磷酸溶液，将25克偏磷酸溶在100mL双蒸水中（2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸，定容到100mL。 （3）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100 g、丙酸0.3700 g、丁酸0.1765 g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100 mL。2样品制备(1) 发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定 1ml样品到离心管中，再加入0.2 ml的偏磷酸巴豆酸混合溶液，20冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心10min，取上清液保存，测定前再12000rpm离心10min(或少许通过0.22m针式滤器，滤液直接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.21.0L。(2) 食糜及粪样VFA测定 取1克置于离心管中，加入510倍的双蒸水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。 3保留时间的确定与样品处理相同，在1 ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。4有机酸浓度的计算通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或浓度）与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。 （样品某酸峰面积值巴豆酸标样峰面积某酸标样浓度）某酸浓度(mM)（样品中巴豆酸面积值标样某酸峰面积）5有机酸重现率 将某有机酸（如乙酸）连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。乙酸重现率变异系数： 1.28720.06404丙酸重现率变异系数： 0.51040.01961丁酸重现率变异系数： 0.34220.01037异丁酸重现率变异系数： 0.46680.01447戊酸重现率变异系数： 0.14310.01754异戊酸重现率变异系数： 0.16710.03496丙酸乙酸 巴豆酸6. 不同标样有机酸的GC峰形丁酸异丁酸 戊酸异戊酸巴豆酸戊酸异戊酸丁酸乙酸丙酸异丁酸 混合标样 样品 标样的分子量和出峰时间沸点分子量出峰时间巴豆酸86.091.95min乙酸11860.050.87min丙酸14174.081.0min丁酸163.588.111.2min异丁酸154.588.111.06min戊酸102.141.68min异戊酸102.141.38min气相色谱的气体工作条件（VFA测定）钢瓶减压阀压力气象色谱压力表氢气0.14MP