质粒转化大肠杆菌ppt课件

.,质粒转化大肠杆菌,.,1、重组质粒的鉴定当质粒的重组或其他载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因，若重组成功，或不含质粒的自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2、为扩增质粒和其他载体作准备由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时间内极大的扩增目的质粒。,一、实验目的,.,二、实验原理,通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生51062107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。,.,三、实验流程：,灭活物/质粒,转化大肠杆菌,挑菌,摇菌,菌液PCR,.,四、实验方法-冻融法,连接产物灭活70，10min,（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞50l、灭火物10l,混合物，冰上放置30min,42,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液体（无抗）,37，振荡1h,离心10000rpm,1min,RT,去上清800l,留下200l上清于1.5ul离心管中重悬,涂板,37恒温箱，倒置培养12h(时间不得超过20h),.,1、无菌落，失败，或培养条件不充分。2、菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。3、菌落布满，抗生素浓度太高，失败。4、出现菌落，符合要求。,（1）,（2）,（3）,（4）,.,五、结果分析和失败原因,（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。（2）无菌落，说明实验没成功。（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。,1、结果分析,.,1、平板中的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌。2、倒Ka平板时，培养基太烫，应冷却到50以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大，涂布环或者涂布棒灼烧过热，或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范，染菌。,2、转化失败的原因,.,六、大肠杆菌感受态细胞的制备,（1）从LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10单菌落于50mlLB培养基中，37振荡过夜；（2）将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右；（3）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下4100rpm离心10min。（4）弃掉上清,加入30ml0.1mol/L预冷的CaCl2溶液，重悬，冰上放置15-30min后，4下4100rpm离心10min；（5）弃掉上清，加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl，加入无菌甘油300l，重悬混匀,冰上放置几分钟；（6）分装，每管100l，液氮冷冻后,保存于-70冰箱。,.,七、挑菌、摇菌,（1）离心管标号（2）每个管内吸入650lLB+Ka抗生素（3）用牙签挑取单个菌（4）摇床上摇菌（时间大于8h）,准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素,.,八、蓝白斑筛选原理,蓝白斑筛选-筛选重组子：根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有-半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培养基中形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,.,蓝白斑筛选：（1）未转化的菌不具有抗性，不生长；（2）转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；（3）转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。,.,九、菌液PCR验证,加样：easybuffer