【毕业学位论文】H5N1 猪流感病毒进化及其对鸡致病力致弱的分子基础研究博士论文

密级: 绝密 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 流感病毒进化及其对鸡致病力致弱 的分子基础研究 5of 5交日期 2007 年 6 月 博士研究生： 朱启运 指导教师： 陈化兰 研究员 申请学位类别： 农学博士 专 业： 预防兽医学 研究方向： 动物流感病毒分子生物学 培养单位： 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 h. D 5of of 5 h. D 2007 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 流感病毒进化及其对鸡致病力致弱的分子基础研究 论文作者 朱启运 专业 预防兽医学 研究方向 动物流感病毒分子生物学指导教师 陈化兰 研究员 培养单位（研究所） 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称 硕（博）导师 单位 专业 签名 李一经 教授 硕导 博导 东北农业大学 动物医学 王君伟 教授 硕导 博导 东北农业大学 动物医学 评 阅 人 步志高 研究员 硕导 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 答辩 主席 王君伟 教授 硕导 博导 东北农业大学 动物医学 王君伟 教授 硕导 博导 东北农业大学 动物医学 崔玉东 教授 硕导 博导 八一农垦大学 细胞生物学 李景鹏 教授 硕导 博导 东北农业大学 分子遗传学 孔宪刚 研究员 硕导 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 吴东来 研究员 硕导 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 相文华 研究员 硕导 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 答 辩 委 员 仇华吉 研究员 硕导 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 会议记录（秘书） 刘春国 论文答辩时间地点 2007 年 6 月 11 日 哈尔滨兽医研究所三楼学术报告厅 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签字： 时间： 年 月 日 I 摘要 我国 1996 年从广东鹅体内分离到第一株 型禽流感病毒， 2001 年从福建猪体中分离到第一株 型猪流感病毒，以及 2004 年以来东南亚暴发的 型禽流感导致数百人感染致死的事实充分证明， 型流感对人类公共卫生构成巨大潜在威胁。 型流感病毒如何在不同种群间任意传播，成为一个悬而未决的重大课题。本研究对 2001 2005 年中国大陆分离到的 17 株 型猪流感病毒进行了生物学特性和遗传演化分析， 并且阐明了两株 型猪流感病毒对 致病差异的分子机制。 本研究首先对我国 2001 2005 年期间分离的 17 株 型猪流感病毒进行了系统的遗传演化分析。 17 株病毒基因组核苷酸序列及其遗传演化分析表明，所有毒株均来源于我国先前分离的型禽流感病毒， 因同源性都很高， 因裂解位点均具有连续多个碱性氨基酸的特征；内部基因与 ，不同毒株根据它们和禽流感病毒的进化关系，大致可以划分为 5 个群系， 7 个基因型。 根据遗传进化分析的数据，选择 7 株具有时间和地域代表性的猪流感毒株进行了生物学特性的研究。 的研究结果表明， 7 株猪流感病毒有 6 株病毒对 均表现为高致病性，静脉致病指数介于 间，一株猪流感病毒 ；鼻腔感染试验表明， 6 株病毒很快突破呼吸系统，引起 全身性感染。 ，症状不明显，组织脏器病毒滴度较低。 进一步利用 c 小鼠模型来评价 型猪流感病毒对哺乳动物的感染能力。上述 7 株病毒分别以 106c 小鼠，根据感染后小鼠体重变化和病毒在小鼠肺脏中生长滴度的结果，可以看出， 7 株猪流感病毒均能够在小鼠肺脏复制，但复制水平有一定差异，其中 ，对小鼠致死能力最强，可能因为其 27 位氨基酸为 K 的缘故。 7 毒株除了 ，其它猪流感毒株均能够引起小鼠不同程度的死亡。 通过对猪流感病毒遗传演化分析及部分毒株生物学特性的研究，我们选择 ，来阐明他们对 致病表型差异的分子机制。 ， 而 ， 两株病毒的核苷酸同源性非常高， 在 M 和 段上部分氨基酸不同。利用反向遗传学技术救获了一系列重组病毒。 的试验结果表明， 因是引起致病表型差异的一个决定因子。进一步对 因在致病性中的作用进行研究结果表明，在病毒感染细胞后， 白是病毒诱导宿主干扰素（ ）产生的拮抗剂， 195 位缺失 5 个氨基酸，影响了 蛋白结构功能，导致了 拮抗 ，所以表现出对 的致病表型为低致病力毒株。 综上所述， 本研究系统研究了 2001 2005 年间分离自中国大陆的 17 株 型猪流感病毒，现这些病毒均来自于我国早期分离的 型禽流感病毒，表现为多个基因型，说明我国 且研究结果表明并没有发现这些病毒和猪源或人源的 型流感病毒发生片段内或片段间的重组。大部分毒株能够在哺乳动物小鼠体内复制。利用反向遗传操作系统，首次证明， 白 191 195 位氨基酸对流感病毒的致病表型具有决定性作用，并精确阐明 因通过拮抗干扰素基因的表达来决定流感病毒致病性的分子机制。 关键词： 猪流感病毒， 型， 进化分析， 致病性， 分子机制 5N1 996 001 004 57 61 it is 5N1 5N1 to in In 17 5 001 005 PF To of 5 of 7 of 996 001 , 0/012/009/00 On of A A of 7 in A A is no of in to of 7 .5 of , on On of to in is in to , we , to is a 5 at 12of S , ( , 17 001 005 5N1 in of we in 91S1 a in is S1 of of H5 目录 第一章 引言 1 论 1 型流感流行特点及其危害 1 型流感病毒致病性分子基础 4 病机理 4 感病毒蛋白与病毒致病性关系 5 感病毒与细胞凋亡 9 语 10 型流感病毒的反向遗传技术 10 感病毒反向遗传技术的发展过程 11 感病毒反向遗传技术的应用 13 国 型猪流感病毒研究的目的和意义 14 第二章 型猪流感病毒的遗传演化分析 16 料与方法 16 毒株 16 16 要试剂与仪器 16 物设计 17 传演化分析试验 17 果 20 列测定结果 20 20 21 因 25 因 25 26 34 基因 34 39 0 型禽流感病毒基因型划分结果 39 论 44 5 亚型猪流感病毒的遗传进化特点 44 45 46 第三章 型猪流感病毒的致病性实验 48 料与方法 48 毒株 48 48 胚半数感染量（ 定 48 脉致病指数（ 测定 48 腔感染及病毒滴定试验 48 株病毒对小鼠的致病性试验 49 鼠脏器的病毒滴定 49 果 49 胚半数感染量（ 定结果 49 49 50 0651 0651 论 52 国 型猪流感病毒对 52 国 型猪流感病毒对 53 5 亚型猪流感病毒在流感大流行中可能发挥的作用 54 第四章 型 56 料与方法 56 毒株 56 验动物 56 56 要试剂 56 物 56 病毒 转录与 57 组 57 毒拯救 58 本毒株及其救获毒株对 58 本毒株和 59 59 59 血清的制备 59 白表达水平 60 因对 60 果 60 株猪流感病毒与 2/00 的遗传关系 60 5型猪流感病毒对 61 5型猪流感病毒对 62 5型流感病毒对 63 5型猪流感病毒诱导干扰素水平的结果 64 5型猪流感病毒感染细胞后 因及其蛋白表达情况 64 因对 66 论 67 5型猪流感病毒和宿主和谐共存的基础 67 因与宿主干扰素诱生的相互关系 68 白对宿主细胞蛋白合成的抑制作用 68 因在增强病毒感染谱中的作用 69 因在疫苗开发及抗病毒药物研究中的应用价值 70 第五章 结论 71 参考文献 72 附录 88 致谢 116 简历 117 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 论 正粘病毒科分为 3 个病毒属： A、 B 型流感病毒属 (, B), C 型流感病毒属()， A 型流感病毒宿主极其广泛，从包括人在内的各种动物如猪、马、海生哺乳动物以及各种鸟类体内都可分离到型流感病毒 (et 1992)，型流感病毒根据血凝素（ 分为 16 个亚型，根据神经氨酸酶 (分为 9 个亚型，各种亚型都可从禽类中分离到（ et 1996; et 1996a， et 2004a） 。 A 型流感病毒的致病性与毒株和宿主均有很大关系，不同毒株对同一宿主或同一毒株对不同宿主的致病性差异很大，根据毒力强弱将禽流感病毒划分为高致病性、低致病性和非致病性毒株 (et 2000)。高致病性禽流感病毒仅包括 型中的部分毒株，由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率达 %以上，因此被国际兽医局（ 为类传染病。年之前，尽管人和其他灵长类动物可人工感染禽流感病毒 (et 1982; et 1991)，但在这些宿主体内禽流感病毒的复制受到很大限制，使人们一直认为禽流感病毒在自然界不能跨越种间屏障直接感染人类，然而年香港爆发的 型禽流感导致人死亡事件，使人们清楚的认识到禽流感不仅可直接由禽感染人，而且还能致人死亡 (et 1998; et 1998)。 年荷兰 导致人死亡 (et 2004b)，年亚洲亚型禽流感，导致泰国人感染，人死亡，越南人感染，人死亡 (et 2004)。截至 2006 年 12 月份， 方公布的数据是， 61 人感染，其中造成 157 人死亡 (2006)。这些事件的发生使人们更加肯定禽流感正在不断的获得感染人的能力，它的危害已不仅是对养禽业的破坏，更重要的是它对人类健康也构成极大威胁。 型流感流行特点及其危害 年意大利暴发由高致病性禽流感引起的 “鸡瘟 ”到现在已有多年的历史了，在此期间， 对禽流感和禽流感病毒的认识不断增加， 年首次从鸡体内分离到引起意大利 “鸡瘟 ”的病原 / 902( ,这也是人类首次分离到流感病毒，比首次分离到人流感病毒提前了 0 年 (et 2001, )。 1930 年 次分离到第一株 型猪流感病毒 (1931), 1936 年， 道用鸡