【毕业学位论文】（Word原稿）牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位的表达及重组G1蛋白抗原间接ELISA方法的预防兽医学建立博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 牛流行热病毒糖蛋白 原表位的表达及重组 白 抗原 间接 法的建立 of 1 of 1 I 牛流行热病毒糖蛋白 原表位的表达及 重组 白 抗原 间接 法的建立 摘 要 牛流行热（ 由牛流行热病毒（ 起的一种急性传染病，首先发现于 19 世纪中期的东非，随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。 5 种结构蛋白，其中 G 蛋白是主要的免疫原性蛋白 ，其 表面存在 5 个抗原位点， 特有，只与牛流行热病毒阳性血清发生反应，而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应，因此我们选取 原表位进行克隆表达和蛋白纯化。 将 得到的 重组 白作为包被抗原，建立检测 清抗体的间接 发相关的试剂盒， 为该病的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平监测提供技术支持。 本研究从 国标准毒株 中提取总 过 法扩增原表位目的基因。 序列分析发现，克隆的 原表位 基因 与 氨基酸同源性为 与澳大利亚株的核苷酸同源性为 氨基酸同源性为 目的基因在 得到胞外分泌的可溶性目的蛋白，蛋白大小约为 得到主要以包涵体形式存在的重组蛋白，蛋白大小约为 体免疫实验和特异性分析，两种蛋白均具有良好的反应原性、免疫原性和特异性，可作为包被抗原，建立 法。 以 达的重组蛋白 作为包被抗原， 经过各种反应条件的优化，建立了检测 清抗体的间接 法。 本 研究表明，；血清和酶标 抗体 的最佳稀释度分别为 1:20 和 1:200； 抗原包被后以37 1h 转入 4 过夜包被效果较好；封闭后以 37 1h、血清加入后以 37 1h、酶标抗体加入后以 37 1h 反应，为 适反应温度和间隔时间。判定标准为：标准阴性血清对照孔 的平均值 2 为阈值，所测样品的 大于或等于阈值判为阳性，小于阈值判为阴性。 该法有 良好的敏感性、特异性和重复性，有临床实用价值。 在毕赤酵母 表达的可溶性目的蛋白作为包被抗原，也建立了间接法。该方法敏感性和重复性较好，但特异性和符合性较差，其根本原因是目的蛋白纯度较低，必须有行之有效的纯化方法，该蛋白才有应用价值。 本试验对 剂盒的开发作了初步研究。确定了试剂盒的组成成分，其 保存条件、保存期、特异性、敏感性、符合性以及批内和批间的稳定性 都有了可靠的检验数据 ， 有望开发成可上市的试剂盒。 关键词 ：牛流行热病毒； 原表位；毕赤酵母；大肠杆菌； 表达；纯化； 间 接 剂盒 of 1 by is an of nd in in of of or is 1 is so 1 is 1 as it in to EF By of of of s of s A 6 1 be as to 1 as by of :20 :200 h 7 . h 7 , h 7 h 7 . 2.1 as A if or to or 1 as So 1 be as a is in s or be EF in 录 第一章 绪论 . 1 研究的目的和意义 .研究历史概述 .病原 .流行病学 .诊断 .免疫与防制 .二章 蛋白 (G)基因的克隆 . 10 料和方法 . 10 果 . 15 论 . 16 第三章 原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定 . 18 料和方法 . 18 结果 . 25 讨论 . 29 第四章 原表位基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗 原性鉴定 . 30 材料和方法 . 30 结果 . 33 讨论 . 36 第五章 大肠杆菌表达重组 白 间接 法 的建立 . 38 材料和方法 . 38 结果 . 41 讨论 . 48 第六章 毕赤酵母表达重组 白间接 法的建立 . 49 材料和方法 . 49 结果 . 50 讨论 . 55 第七章 1断试剂盒的初步研制 . 56 材料和方法 . 56 结果 . 58 讨论 . 60 第八章 结 论 . 61 V 参考文献 . 62 附 录 . 75 致 谢 . 79 作者简介 . 80 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 牛流行热 流行热病毒 血清白蛋白 ,3,3碳酸二乙酯 氧胆酸钠 二胺四乙酸 联免疫吸附试验 胱苷肽 根过氧化物酶 丙基 D 硫代半乳 糖苷 B 培养基 苯二氨 转录 V 犬病病毒 二烷基磺酸钠 二烷基肌氨酸钠 43中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪论 研究目的和意义 牛流行热（ 由牛流行热病毒（ 起的 牛和水牛的 急性传染病，其 特征是突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、 跛 行。 该病传播迅速，流 行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生。该病可 导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给 养牛业造成重大经济损失 （ et 2003, 2005） 。 5 种结构蛋白，其中糖（ G）蛋白是主要的免疫原性蛋白。 G 蛋白表面存在 5 个抗原位点（ 其中 非构象化位点， 2、 所有毒株中稳定存在， 在不同毒株中存在差异 （ et 1991, 1992, 1994; et 1992; et 1995; et 1998; et 2000） 。 特有，只与牛流行热阳性血清发生反应，可以特异性 检测血清抗体，而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应 （殷震 等 ， 1997） 。因此我们选取该抗原表位基因进行克隆表达和纯化，所得的纯化表达蛋白 作为包被抗原，建立检测 清抗体的特异性 法，为开发相关的试剂盒奠定 了基础。 研究历史概述 1867 年 次报道本病发生于东非，随后在津巴布韦、肯尼亚、南非、印度尼西亚、印度、埃及、巴勒斯坦、澳大利亚、日本（ 1949）等国都有发 生。该病在广大的非洲和南亚地区流行，并且养牛业的快速发展又促使本病向更广泛的地区蔓延，至今已有百余年历史 （ et 2001; et 2005; et 2005; et 2005） 。我国在建国前后，就有牛流行性感冒暴发流行的记载。直至1976 年本病暴发流行期间，才从北京暴发流行本病的某奶牛场，采集了病牛高热期的抗凝血或脱纤血，通过乳鼠脑内传代和 21 细胞盲传的方法成功分离出我国第一株牛流行热病毒， 1977 年和 1983 年又 分别从广东、安徽分离出该病毒 (1991)。 在检测和控制本病方面，目前尚未建立起国际标准化的诊断技术，但许多国家的研究者都在特异性血清学诊断方法方面进行了大量有意义的研究工作。如日本、澳大利亚、南非和中国等在半微量补体结合反应、微量血清 细胞 中和试验、免疫荧光技术以及 验方面进行了研究，取得了有意义的进展。 在免疫疫苗方面，各国学者也进行了许多研究。没有分离到病毒以前研究者都以发病牛高热期的血液为材料制备各种灭活疫苗。通过乳鼠脑内接种和细胞培养技术分离到病毒以后，就将细胞适应毒感染 多种细中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 2 胞，获得大量的细胞病毒液制备灭活苗和弱毒疫苗。近年来利用分子生物学技术制备亚单位苗也取得一些进展。 病原 本病的病原是牛暂时热病毒 (。目前，把 狂犬病病毒、水泡性口炎病毒等一起归于弹状病毒科 （ ，这是因为这些病毒都具有以下几点共性： 1)外型为子弹型； 2)核酸为单股负链 3)具有 5 种结构蛋白； 4)对脂类敏感等。但 同科其他病毒在宿主范围、生理周期、产热机理、免疫反应等方面均存 在较大的差异。因此，对于 病毒分类学上所处的位置仍有争议。1994 年 议将它正式列为弹状病毒科暂时热病毒属。 病毒 的 形态 学 与理化特性 子弹状或圆锥形 (殷震等， 1997)。成熟病毒粒子长 10045 病毒粒子有囊膜，囊膜厚约 10面具有纤细的突起，该突起由糖蛋白 G 组成。粒子中央为电子密度较高的核心 将核衣壳拉直，长达 衣壳由 N 蛋白、 L 蛋白及 白组成，外部包围着由 白 组成的脂类膜，具有感染性。除典型的子弹形病毒粒子外，还常可以看到 T 粒子，即截短的窝头样病毒粒子，特别是在以高浓度病毒传代的细胞培养物内。 我国分离的 京株 (瞿中和等， 1992)，负染样本的病毒粒子直径为 85 170膜厚 11薄切片样本的典型毒粒大小为 80160样除这些典型毒粒外，也可观察到形态大小略有差异的病毒粒子，有的略粗短，大小约 102152的略长些，端部钝圆，大小约 80200些粗短的粒子可能是一种缺陷病毒粒子 。 在弹状病毒科中这些“缺陷毒粒”本身没有感染力，它专门干扰正常弹状病毒的增殖，起到自家干扰的作用。 热敏感， 56 1037 18h 灭活， 下或 上数十分钟内使之灭活，对乙醚、氯仿等敏感。枸橼酸盐抗凝的病牛血液于 2存 8 天后仍有感染性。感染鼠脑悬液（加有 10%犊牛血清）于 4经一个月毒力无明显下降。反复冻融对病毒无明显影响。于 下低温保存，可长期保持毒力。 分离培养 病毒存在于病牛血液中，用高热期病牛血液中的白细胞层和血 小板层脑内接种新生小鼠，可使小鼠发病，初代潜伏期为 10，发病率低，连续继代时潜伏期很快缩短为 3 天左右，发病率可达 100%。乳鼠表现为神经症状，易兴奋，步态不中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 3 稳，常倒向一侧，皮肤痉挛性收缩，多数经 1死亡。 在没有分离到致病病毒之前， 1907)最早用病牛高热期血液给健康牛静脉注射使牛发病，把致病因子保存下来，以后各国的研究者都采用将病牛高热期的血液，通过牛体传代的方法来保存。自 1967 年 南非用乳鼠脑内接种病牛高热期血液的方法首次分离到病毒以后 ，在日本、澳大利亚等国家的研究者用同样的方法也分离到了病毒。 1976 年我国在北京某奶牛场分离到牛流行热病毒。继用乳鼠分离病毒成功之后，研究者又通过在细胞上盲传几代的方式，获得了胞适应株，并伴有明显的 而又将病毒接入 鼠肾、牛胎肾和 各细胞上，也均能增殖和出现 用病毒细胞培养技术获得纯病毒，从而使研究病毒自身的结构、功能得以实现。到目前为止，还没有发现各国分离的流行热病毒之间存在型的差异。 告在乳仓鼠和乳大鼠脑中也能增殖，并首次在 织培养细胞中成功地增殖并产生细胞病变。接着， 将 种 在猴肾细胞系 ( 、仓鼠肺细胞系、大鼠胚胎皮肤细胞及成纤维细胞、牛肝脏、肺脏、脾脏及肾体外培养细胞、胎牛睾丸体外培养细胞、伊蚊体外培养细胞中增殖。但在这些细胞中增殖的病毒往往产生大量缺陷干扰颗粒 (，给提纯病毒带来一定的困难。 自 1967 年南非首次分离到病毒以后，到目前在日本、澳大利亚和中国分离的病毒株，用交叉中和试验证明这些病毒在免疫学上是相同的，没有型的差别。从对澳大利亚 和中国 L 基因间及 G 蛋白基因序列分析结果看，两者在核酸水平上有 91%的同源性。由此推测，本病毒各分离株间的同源性很高，差异极 小。 病毒基因组结构及功能 通过对病毒核酸的研究表明， 核酸为单股负链、不分节段 度为 中 11 组基因己被确定，从 3一 5端的顺序依次为 3 N M 1 M 2 一 G 一 G 1 2 3 L 一 5，第 25核苷酸之间为插入区， 和 L 基因之间具有 21 个核苷酸的重叠区。除 1 基因外，其余所有基因均以一 序列 起始，转录合成的 5端有帽子结构，其基因起始序列为一 ，终止序列 A) 6在这些基因中， N、 M 1、 L 和 结构蛋白基因。 核蛋白基因（ N） N 基因为核蛋白基因，含有 1328 个核苷酸，基因以 守序列起始，并以 A) 7 序列结束 （ et 1994; et 1995） 。该基因编码含 311个氨基酸的 49蛋白质，氨基酸序列与 近。以大肠杆菌表达的 N 蛋白和谷胱 苷肽 (S)转移酶 N 融合蛋白能够与 蛋白特异性抗体发生免疫反应。研中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 4 究表明， 蛋白为磷酸化蛋白，是转录 与负链 合，识别转录终止信号及 A）信号，调控基因转录，启动基因复制，同时能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫过程。 合酶大蛋白基因 (L)及基质蛋白基因（ L 蛋白基因能够编码 180蛋白（ J, 1991），具有 赖的 有蛋白激酶的活性，对基因的转录 和复制具有调控作用。白基因编码 43 蛋白，是病毒多聚酶成分之一，在感染细胞的细胞质中以可溶性成份存在，能够阻止 N 蛋白的自身凝集，帮助 N 蛋白脱离核衣壳与 离，刺激机体产生细胞免疫。编码 白的基因位于 G 蛋白基因上游，该基因编码 29白，是一种磷酸化蛋白，主要位于毒粒内部，可能具有调控 录的作用。 L， M 1 和 N 蛋白是病毒核衣壳的重要组成部分； 核衣壳外脂类膜的重要组成成分。 结构糖蛋白（ G）及非结构糖蛋白（ 因 紧邻 因下游的是编码 蛋白的两个相连基因 G 和 白基因，距 N 蛋白基因 et 1992） 。 G 蛋白基因全长约 1872具有典型的 始序列和 A） 7结束序列。该基因编码含 623 个氨基酸、分子量为 81 糖蛋白。在该基因 N 端是典型的真核膜蛋白信号肽序列区，包括 N 末端负电荷区和与肽酶切位点相近的多极化区域。该位点在其它 清型病毒和狂犬病病毒中表现为 基酸残基。在 蛋白氨基酸序列中第 13 和 18 氨基酸残基为 两个位点哪个 是 信号肽切割位点尚未确定。在 氨基酸序列中含 16 个氨基酸长的疏水氨基酸区，与 R 或 K 氨基酸相联，这是该病毒转膜区域的典型特征。由此认为 蛋白转膜疏水区与 两 个氨基酸残基有关，包括了两个负电荷残基 G 蛋白是 要免疫原性蛋白，位于 粒囊膜表面，形成突起。 0%，它的糖基化对蛋白质的空间构象起着重要作用，决定着抗原决定簇的形成。糖链构象的正确与否直接影响着 G 蛋白能否组装到毒粒之中。利用单克隆抗体技术分析， G 蛋白表面存在 5糖基化位 点（ 4）， 非构象化位点， 所有毒株中稳定存在， 不同毒株中存在差异。 白基因紧邻 G 蛋白基因下游，基因全长 1757括一个信号肽区、疏水转膜区和 8 个 N 糖基化位点。 白与 以及其它弹状病毒 G 蛋白具有相似的氨基酸序列。尽管以哺乳动物细胞表达的 白与 G 蛋白表达水平相当，中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 5 并具有其它弹状病毒外膜糖蛋白的特征，但在病毒颗粒中却未发现 存在。 相关病毒 特有的非结构糖蛋白，已证明 G 和 白均在内质网中去掉氨基端的信号肽序列，并在高尔基复合体中发生糖基化，最后转移到细胞质的质膜上。只有 G 蛋白与 出芽和成熟有关，而 与此无关。现认为 自然感染的组织中，可能与增强 染细胞的能力有关。 间的基因组成及转录机制 在 因与聚合酶基因 L 之间是 1622 段 (M,1997)。这一片段含五个 码三个转录子（ 、和 ），每个转录子均含有典型的保守序列（ A） 7 结束序列。 区含三个 1、 2、 3）， 1 编码 白，具有疏水区和典型的病毒外膜蛋白特征。 2编码 白， 3 编码 白，两基因具有重叠部分。 编码 白， 编码 白。这些蛋白质的功能尚未确定，只是根据 1 蛋白的特点，推测它可能与病毒外膜的形成有关。在弹状病毒中， 因变异很大，有人推测该区某基因与 L 基因的表达调节有关。 流行病学 行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。我国 1949 年以前就有本病在部分地区发生流 行的记载，随后我国 25 个省市均多次暴发流行 (1991)， 但从1991 年至今未见有大规模流行的报道。 牛流行热为非接触感染，它由节肢动物传播，呈周期性流行。根据多年流行病学观察，周期性由过去的 10流行一次，到近年来流行周期缩短至 3或 6的地方甚至更短，如广东省从 70 年代以后，它的流行周期缩短到间隔 1就有一次流行。 本病发生于夏末秋初。由于我国幅员辽阔，南北纬度差异很大，东西走向又存在不同地域之差，因而本病在不同地区流行始末时间也不完全一样。在几次大流行中，广东省都先于我国 其它一些省份。 1991 年在全国暴发本病时，也是广东省于 5月份开始出现，先于别省。据记载， 1983 年全国流行本病时，广东省 6 月份开始发病，流行传播持续到 11 月份。 1988 年该省本病流行持续时间也与 1983 年相似。地处我国中部偏北的安徽省， 1983 年从 7 月至 10 月流行本病，持续 3 个多月的时间；1987 年从 7 月至 11 月， 1988 年 6 月至 10 月和 1991 年 6 月至 10 月流行本病时，持续时间为 4 个月左右。 1991 年广东省发生本病流行时，由于实行了疫苗紧急接种，全省的疫情于 8 月中旬就受到了控制。山东省于同年 7 月发病时，济 南牧工商联合公司的奶牛场应用同上的疫苗进行了紧急预接种，也收到迅速控制本病的效果。位于我国东北的吉林省于 1991 年 8 月 10 日至 10 月 10 日在部分地区也出现了牛流行热的流行，流行持续时间 2 个月。其它省份多从 7 月开始发病至 10 月初或 10 月底中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 6 疫情终结。从上述流行时间来看，本病的流行具有明显的季节性。 本病发生迅猛，在传播扩散方式上，不受山川河流的阻碍，呈跳跃式蔓延。发病疫区不是联接成片，而是疫区与非疫区呈相嵌的形式存在，即疫区与疫区之间交叉存在无病的清净区。媒介昆虫的存在是本病得以传播的中心环节。本病不能 直接接触传染，而是通过媒介昆虫吸血叮咬带有病毒血症的病牛来传播扩散本病。据记载，肯尼亚和澳大利亚 已 分别从 蠓中分离到国安徽省也在媒介昆虫、库朦种类、优势库朦种的吸血嗜性、活动习性和库蠓的人工饲养等方面进行了研究观察，并对库蠓的滋生地及其越冬态进行了初步调查。这些研究无疑将对 及其它虫媒病毒传递机制的阐明提供依据。尽管本病自然发生的传播机制还有待进一步阐明，但从牛流行热呈跳跃式的传播扩散，不受自然屏障的影响来看，符合虫 媒病毒传播的一般规律。据报道，牛流行热在北半球发生地区，在日本不超过北纬 38 ；在南半球，该病很少穿过澳大利亚西部和中部南纬 25 和东部的 36。上述北纬 38 以南和南纬 25 以北是媒介昆虫滋生活跃的地区。 1991年 8 月位于我国北纬 44 的吉林省一些地区出现了牛流行热，这与上述报道的差异甚大。这说明，吉林省发生的牛流行热突破了该病发生生物圈的历史记载。在北半球的日本和我国吉林省发病出现地理位置的差异，可能与天气气温变化，媒介昆虫北移或者是吉林发病地区本来就存在这种传播媒介昆虫等因素有关。这个问题给昆 虫学家和生物学家留下一个很大的课题，需进一步对媒介昆虫的种类、分布、栖息地以及媒介昆虫带毒传播方式等加以调查研究。 发病率高，死亡率低也是牛流行热的一个特点。以 1991 年爆发流行为例，山东全省发病 头，发病率为 死亡 2498 头，死亡率 山西省晋中地区发病 15679 头，占存栏牛的 死亡 45 头，占存栏牛的 占病牛的 。广东省按 18 个发病牛场的统计，发病牛数为 2572 头，占存栏数的 死亡 75 头，占发病牛的 占存栏牛的 吉林 省发病牛数 23418 头，发病率为 死亡 204 头，死亡率为 上述列举的数据说明牛流行热发病率高，死亡率低的这个特点。此外，有人观察到牛的品种、年龄、妊娠、饲养密度以及气温的异常干、湿等与本病的发生也有一定关系，如奶牛、黄牛敏感，水牛钝感 :中壮年牛比犊牛和老龄牛发病率高等。 1991 年上海奉贤县发生牛流行热时水牛未见发病，但中和抗体检查其阳性率高达 可见水牛呈隐性感染。哈尔滨兽医研究所科研人员在进行牛流行热抗体调查时发现，自流行过本病的地区收集的血清样品中检出了 4/420 的样品含有 毒血清抗体；在 116/192 血清样品中含有毒抗体；在 63/131 的血清中含 毒抗体。这说明，在我国也存在牛流行热类病毒血清抗体。上述类病毒均不能使牛临床发病，呈亚临床感染。由于类病毒的存在，出现假阳性，给牛流行热抗体检测带来麻烦。此外，从一些地区报告材料可以看出，在每次发病流行时，在病牛群中都有数量不多的病牛表现出咽喉头麻痹的症状。日本于 1959间流行本病时，从咽喉头麻痹的病牛中分离到蓝舌病病毒。我国在牛流行热流行期间出现咽喉麻痹症 状的牛