第三章 生化制药反应器-2006

第三章生化制药反应器,3.1生物发酵培养基的流变学特性3.2微生物发酵反应器3.3动植物细胞培养反应器,3.1.1研究发酵液流变学特性的原因和意义,发酵液的流变学性质直接影响以下因素:生物反应器的整体混合行为如传质过程和热传递影响微生物反应的周期和产出影响传感器的响应和可靠性对产品分离纯化也起着很大的作用。敏感地指示发酵状态，可用于过程检测和控制。,发酵液组成,多相液相：水固相：细胞以及不溶物气相：好氧发酵（气泡）,发酵前：一般，接种前的培养基的流变学性质类似于水。随着发酵的进行，其性质会变得很复杂而且常常是对发酵过程是不利的。影响流变学性质的因素:生物量的增加代谢产物的积累(胞外多糖、蛋白质),生物量增加对流变学的影响,在丝状菌发酵中，生物量的作用很显著，以菌丝形式生长比以菌球形式生长对流变学性质的影响更大。在一般培养密度下的细菌和酵母，对流变学性质的作用不大。,胞外代谢产物的影响,迄今所研究的胞外产物中，只有多糖对流变学性质的影响较大。与丝状菌发酵液不同，含多糖的发酵液的流变学性质是由连续相所确定的。其他大分子（如蛋白质），特别是存在分散的很小的气泡时，也会影响流变学性质，但在生物过程中并不常考虑。,胞外酶的影响：还有一种很特殊的情况，初始培养基中含较高浓度的淀粉，表现出复杂的流变学性质。发酵开始后，胞外酶的水解作用很快减少了营养物的平均相对分子量，从而迅速降低了发酵液的黏度。,流变特性通过影响流体特性而影响传质和传热，从而影响生物化学反应和细胞的新陈代谢，即反应器生态系统中的流变学影响甚至决定其内部的生物反应动力学。因此，在生物反应器的优化设计中应该对发酵液的流变学特性引起足够的重视。,3.1.2流体的流变学分类,流变学通常用黏度（对流体的抗性）、流动行为（黏度和剪切率的关系）和屈服应力（产生静液流需要的力）等术语来描述。液体流变性通常是根据一个表达式来分类，即所施的剪应力与产生的剪切率的关联式：,其中K为幂定律常数或黏度系数，0为屈服应力n为幂定律指数或流动特性指数。此方程为幂定律方程。,流体的流变性分类,牛顿型流体牛顿型流体的黏度在温度恒定时保持不变，气体、低分子的液体或溶液为牛顿型流体。一般说来细菌和酵母的培养液是牛顿型流体。,非牛顿型流体不服从牛顿黏性定律的流体为非牛顿型流体，其剪应力与剪切率之比不是常数，随着剪切率的变化，没有确定的黏度值。,非牛顿型流体分类,根据非牛顿型流体的剪应力与剪切率的关系，又可以分为多种类型。常见的有以下几种：（1）宾汉（Bingham）塑性流体（2）拟塑性（Pseudoplastic）流体（3）涨塑性流体（4）凯松流体,（1）宾汉（Bingham）塑性流体,Bingham塑性流体的特点是当剪应力小于屈服应力时，流体不发生流动，只有当剪应力超过屈服应力时流体才发生流动。它的流动曲线是不通过原点的直线。黑曲霉、产黄曲霉、灰色链曲霉等丝状菌发酵液。,（2）拟塑性（Pseudoplastic）流体,在双对数坐标中一条斜率为n的直线。高分子化合物黄原胶的水溶液许多丝状菌如青霉、曲霉、链霉菌的培养液一些生产多糖的微生物发酵液高浓度的植物细胞、酵母悬浮液,（3）涨塑性流体,表达式与拟塑性流体相同但与拟塑性流体相反，随着切变率的增大，液体的表观黏度也增大。淀粉为培养基主要成分的发酵液。链霉素、四环素、和卡那霉素的发酵过程中，接种后的一段时间内发酵液呈涨塑性。,（4）凯松流体,油墨、融化的巧克力、血液、酸酪等具有凯松型流体特性。青霉素发酵液为凯松流体，对丝状菌悬浮液，凯松方程常常比幂定律方程更为适合。,表观黏度的概念,非牛顿形流体没有确定的黏度值，通常把一定切变速率下剪应力与此剪切率之比称为表观黏度，即：,其中为表观黏度，Pa.s在培养过程中，随着细胞的浓度、形态的变化、培养液里营养物质的消耗、代谢产物的积累、以及补料操作等，培养液流动模型中的参数会发生明显的变化，表现出时变性。此外发酵液的流动特性的类型也可发生变化。,问题:,举例:在什么条件下可从非牛顿流体变为牛顿流体?在什么条件下可从牛顿流体变为非牛顿流体?,3.1.3丝状真菌培养液的流变学特性,一般来说，含有近似球形的微生物体的酵母菌或菌丝球的培养液，黏度低，近似于牛顿流体特性。以长丝状生长的菌丝体，培养物的黏度高，存在屈服应力。表观黏度和屈服应力两者都是菌丝体浓度的函数。丝状生长的产黄青霉的屈服应力和菌丝体浓度的2.5次方成比例，某些丝状生长的霉菌培养液的表观黏度近似的与菌丝体浓度的2次方相关。,3.1.4影响培养液流动特性的因素,培养液的组成:液相部分:水、各种营养成分,细胞的代谢产物固形物:细胞、培养基中的不溶性物质一般在培养液中的液相部分黏度很低，随着其中细胞浓度的增加，培养液的黏度也相应增大。,当培养液黏度与细胞浓度的关系明确时，可以通过测定培养液的黏度来确定细胞浓度。高浓度的细胞悬浮液可成为非牛顿型流体。,多形汉逊氏酵母培养液的黏度与纯液相黏度之比与培养液中细胞浓度的关系,当培养液中的颗粒呈球状或接近球形，而且其浓度较低时，悬浮液为牛顿型流体，其黏度可通过Einstein公式计算。当培养液黏度与细胞浓度的关系明确时，可以通过测定培养液的黏度来确定细胞浓度,3.2微生物发酵反应器,各类生物反应器简介微生物发酵反应器主体设备发酵罐,生物反应器分类,常见的几类反应器如下：机械搅拌式反应器鼓泡反应器气升式反应器膜生物反应器固定床和流化床反应器,发酵罐图,微生物发酵反应器,微生物发酵罐微生物发酵设备:固体发酵和液体发酵；液体发酵罐:厌气和好气。,固体发酵罐,固体发酵有许多液体发酵无所比拟的优势,如为非均相系统,有利于特定培养物的自组织行为;液固相接触比表面积大,一般无液体发酵所面临的高密度培养时溶氧水平不足的问题,具有投资省,无菌性能好,操作环境省,维修简单不易污染环境等优点固态发酵缺点:固体发酵往往在工程放大中面临热量积累导致温度失控问题,固态发酵罐形式,转轴式(立式,卧式)转桶式(卧式)浅盘发酵,醋酸固态发酵设备,固体发酵应用实例,适合于饲料,酶制剂,生物农药等行业固体发酵生产酒(味)精霉菌固态发酵将秸秆转化为SCP生产秸秆饲料,微生物发酵常用的发酵罐,带有机械搅拌的发酵罐这类发酵罐使用最为普遍，因其操作弹性大，易于控制，所以常称通用型发酵罐。气升式发酵罐是利用压缩空气为动力的发酵罐，高径比一般较大。喷射自吸式发酵罐是利用泵为动力并加上通过液体喷嘴将外界空气吸入罐内的发酵罐,机械搅拌式发酵罐,医药工业中第一个大规模的微生物发酵过程青霉素生产是在机械搅拌反应器中进行的。而且迄今为止，对新的生物过程，首选的生物反应器仍然是机械搅拌式反应器。机械搅拌式反应器大多用于间歇反应。,A.机械搅拌式反应器,基本结构：筒体，搅拌装置，换热装置，挡板，消泡装置，电动机与变速装置，空气分散装置检测装置:溶氧电极，pH电极，CO2电极，热电偶，压力表等开口:排气、取样、放料和接种口，酸、碱管道接口和人孔、视镜等部件。,反应器中的传热装置,小的反应器（5m3)则需要在内部另加盘管生物反应器对温度的控制要求苛刻，允许的温度变化范围较小，特别是低温培养。,对于好氧过程，每小时生产1kg生物质约需要移出50至80kJ的热量。热交换的负荷就更大.需要做什么?在外部增设制冷设备，降低冷却水的温度。,反应器中的通气装置,好氧过程中，气体分布器置于反应器底部最低层搅拌桨叶的下面。气体分布器有带孔的平板、带孔的盘管或只是一根单管问题:为防止堵塞,孔口应该做什么?一般孔口朝下。,反应器的混合装置,如何实现混合?物料的混合和气体在反应器内的分散靠搅拌和挡板实现。搅拌器使流体产生轴向运动，称为原生流原生流受挡板的作用产生轴向运动，称为次生流。,挡板的作用是什么?防止由搅拌引起的中心大漩涡。原生流速与搅拌转速成正比，次生流速近似的与搅拌转速的平方成正比，因此，当转速提高时，主要靠次生流加速流体的轴向混合，使传热传质速率提高。搅拌反应器有立式的，也有卧式的。,搅拌器,搅拌器的形状和安装位置决定其在发酵罐内的运行的性能。搅拌器应具有四项作用:将能量传递给液体使气体在液体中分散使气液分离使发酵液中所有组分达到混合,搅拌器的叶轮分类,轴流式叶轮轴流式搅拌器最典型的是螺旋桨。搅拌器中轴向流搅拌器的混合效果最好，但是破碎起泡的效果较差。径向式叶轮径向流搅拌器可分为开式和闭式好氧发酵常用闭式叶轮,B.气升式发酵罐,它是从简单的鼓泡式发酵罐基础上发展起来的，可分升液和降液两个区域。内循环气升罐:空气从位于罐中央的拉力筒导入带动液体同时上升并向液体中供氧，在罐的上部空气逸出液面，液体则从环隙下降以形成循环。外循环或环流气升罐:升（或降）液管置于罐外。,气升罐的优缺点,优点:1、无机械运动部分，易于保持纯种培养2、无噪声，造价较低（1/3的搅拌釜）3、氧的传递效果较好4、剪切力小，对细胞损害小问题：操作弹性较差，耗用压缩空气量较大，所配备电机的功率约为3.55千瓦/m3。,气升罐应用,通过实际试验，特别是具有高粘度发酵液的品种。需氧量大，不耐剪切最大的气升式反应器：目前在英国已制成容积为2300米3（高60米，直径7米）的超大型气升罐，用来生产单细胞蛋白。,它的升液区横截面为双圆缺型，其中有多块多孔板以不断分散气体，降液区则位于罐内双圆缺拉力筒的两侧圆缺部分，原料甲醇从罐壁均匀注入。国内也制作了180250米3的气升发酵罐生产2-酮基-L-古龙酸（维生素C前体）。,C.喷射自吸式发酵罐,优点不需通入压缩空气，关键在于泵的严密性，不致引起污染。应用因为泵的高速旋转造成很严重的局部机械剪切力，故不适宜培养带有菌丝体的真菌和放线菌，一般用于培养酵母。,3.3动植物细胞培养反应器,动物细胞培养生物反应器植物细胞培养生物反应器推动力:医药工业的发展,微生物与动植物细胞的比较,分类,悬浮培养有空气提升式、中空纤维管及陶质矩形通道蜂窝状生物反应器贴壁培养有搅拌槽、中空纤维管和陶质矩形通道蜂窝状生物反应器。包埋培养有流化床、固定床生物反应器。,动物细胞培养生物反应器,哺乳动物和昆虫细胞需要有特殊的培养系统。由于细胞生理学特性，动物细胞培养反应器需具有高度精确的机械装置，能全面控制搅拌、通气和温度等。,动物细胞培养用生物反应器分类介绍,通气搅拌式中空纤维管式气升式无泡搅拌式透析式,通气搅拌式这类反应器是在原有小型通气搅拌发酵罐基础上发展起来的培养装置。针对动物细胞易受机械损伤的特点，采用剪切应力小、混合性能好的搅拌器，其中以NBS公司笼式搅拌器效果最好。,笼式通气搅拌器,1、培养基循环入口2、环形分布器3和10、滤网4、气体交换后排出5和11、培养基循环出口6、排气口7、气体进口9、消泡腔12、通气腔13、不带细胞培养基进入交换,主要组件为中空轴带动旋转的笼式搅拌器构成的通气腔和消泡腔，分别通过200目不锈钢丝网进行气液交换和消除泡沫，搅拌器以3060RPM的低速旋转。其产品型号有1.5L至5L的CelliGen以及15L至1000L的Microlift两大系列，占有世界动物细胞培养反应器的大部分市场。,国内在前者的基础上研制成功20L规模的CellGul-20，设有双层笼式搅拌器，扩大丝网更换面积，提高氧传送系数，也可提供订货。其他类似的结构有MBKSulzer公司的产品，以多孔硅胶管通气，并以旋转的不锈钢丝网进行混合；其他尚有Bioengineering公司的产品，有多种规格。所有这些都能满足微载体系统培养动物细胞的需要。,中空纤维管式,运行方式：细胞在外腔(壳程)生长，1-3周后占据所有壳程，可形成10多层细胞。此时细胞分裂停顿，但其代谢和分化可长期保持可达数月之久。优点：占用空间小，质量高，生长成本低（为小鼠腹水生产成本的1/2，搅拌反应器的1/6）缺点：（1）不能重复使用（2）不耐蒸汽灭菌（3）难取样检测,用于单抗生产的反应器的趋势：从纵向布置纤维管的装置型式向纤维管横向布置形成平板式的浅床结构的方向发展。床层深度控制:通过纤维管的层数，安放在底部和顶部都设有23微米的微孔不锈钢烧结板的矩形容器内，培养基由下面进入，细胞则在纤维管中生长，可以分批培养悬浮生长的细胞，亦可培养贴壁依赖性的细胞。,首先开发成功的这种反应器的Endotronics公司。近年的改进是在反应器的筒体外部加设一膨胀室，用管道与筒体连接，以改善水力学条件，可缩小培养基的浓度梯度，减少细胞培养微环境的差异，获得更高的细胞浓度。已应用于单抗的大规模生产。,气升式,以内循环式为主。器内设置环型管作为气体喷射器以0.0L0.06vvm的空气比进行通气，通过导流筒循环，剪切力比较小，氧传递速率较高，液体循环量大。,Celltech公司首先采用这类反应器进行杂交瘤细胞的悬浮培养生产单克隆抗体，这类反应器的技术关键在于自动控制和细胞培养。溶氧的控制系通过空气流速调节。pH的控制则通过通入二氧化碳进行调节。,根据细胞的倍增时间和细胞密度，从10L的种子逐级移种到1000L培养，需要400h的培养周期，可生产单抗100g。这类罐的罐体规模从1980年的10L规模，已经逐步发展放大到1990年的10,000L。其他如Chemap公司以及国内都有不同的小型规模的产品。,无泡搅拌式这是一种装有膜搅拌器的生物反应器。膜材料：聚丙烯、硅橡胶或其他不致对细胞产生任何毒害而又能够耐受培养基内营养物质侵袭的材料制成，加工成为多孔的中空管。,采用多孔的疏水性塑料管制成的通气搅拌桨，具有很好的氧通透性，同时解决通气和均相化的要求，并且剪切力很小，通气时不产生泡沫，GBF就采用这类反应器培养动物细胞。已经广泛地用于中试和工业生产。,透析式90年代初起步培养分离耦合：(1)培养过程不断取出目的产物。控制透析袋的截留分子量，将产物与细胞分开。(2)避免微量代谢产物的毒害影响，可以大幅度的提高产量。原理：将细胞装入透析袋内，将有害代谢产物如乳酸、氨等滤掉，从而实现高密度培养。,基本结构,1、最初的型式由培养罐、透析罐和透析单元组成2、最新的型式由组装在一具密闭容器内的培养室和透析室构成缓冲营养液和气体由透析室接触混合后进入设置在一侧环绕有透析膜的培养室培养过程的小分子废弃物和排气则通过透析膜扩散到透析室排放。,膜材料有纤维素、聚醚砜、聚丙烯等几种可以进行悬浮细胞培养和固定化细胞培养用于疫苗、单抗的生产，后者的培养周期可长达75天。,应用情况,1998年用于单抗培养工业规模设备已达1000L（由Bioengineering公司提供设备），产量比一般的恒化培养方式提高10倍左右。由于产量特高，如此规模已经十分巨大。,50升（左）和5升（右）动物细胞培养反应器,国产动物细胞反应器,植物细胞培养用反应器分类介绍,已用于植物细胞培养的反应器：机械搅拌式鼓泡塔式气升式转鼓式固定化细胞生物反应器植物组织培养反应器：雾化反应器,搅拌罐式常用于植物细胞的分批培养搅拌器特征：多为低剪切力的、不致粘附细胞的结构，常用棒式、帆式、旋桨式等简易构型，以极低的搅拌转速进行操作，也有采用涡轮桨叶的构型，有人将旋桨式、气升式与之进行紫苏细胞培养的比较，结果以涡轮叶的产量最低。,应用实例,1972年，Kato，30L，连续培养烟草以得到尼古丁。之后放大至1500L，20000L。Fujita,紫草细胞培养生产紫草宁,工业生产,气升式,优点：低剪切，不易染菌缺点：高密度培养时混合不均应用：长春花细胞培养，100L,长春花，生于越南，中国海南。其长春新碱是有效的抗癌药。长春花是植物细胞模型物系。,转鼓式生物反应器,通过转动使反应器内的氧及营养物混合设置档板提高氧传递高密度培养时有高的传氧能力Tanaka用于培养长春花细胞高密度培养时优于搅拌式和气升式缺点：放大困难,固定化细胞生物反应器,1979年，Brodelius开创了用固定化方法培养植物细胞的先河优点：（1）免受剪切力（2）重复使用细胞（3）高密度培养（4）细胞间接触好，易于分化（5）减少细胞的遗传不稳定性（6）易于实现连续化操作,固定化方法,凝胶包埋共价交联吸附表面固定化多孔载体固定化膜固定化,应用实例,辣椒细胞，包埋于聚氨酯泡沫，产量与悬浮培养比提高1000倍，0.5mg/g干重细胞/天Fukui在膜反应器中培养烟草及紫草细胞，细胞生长速率及次生代谢产物合成速率与摇瓶相当。,问题：胞内产物，如何促进产物释放？需要借助表面活性剂或对细胞进行通透性改造,以促进胞内产物的释放；植物细胞次生代谢物的积累是不连续的。,雾化反应器植物组织培养用的新型生物反应器通过反应器底部的陶瓷换能片在震荡电路的作用下产生超声震荡使培养液雾化，雾化营养液由导流筒的循环分布并接触培养物，使植物组织得以生长。,反应器可按常规方式灭菌、控温，亦可进行光照。适用于植物组织培养苗的繁殖，可以降低成本；能够进行多层培养，实现放大要求。,光照生物反应器植物需光合作用，植物细胞的多种酶需要光照的刺激和诱导才能合成或表现较高的生理活性。,光照生物反应器应用,Schmauder（1985年）：培养金鸡纳树细胞生产金鸡纳生物碱。Ogbonna等（1995年）提出了光分布系数的概念，并研制了新型光照生物反应器。,植物细胞培养反应器（5升）,3.4基因工程药物及单克隆抗体生产工艺,基因工程药物的研究现状基因工程药物举例介绍单克隆抗体生产工艺,基因工程药物的研究现状1972年诞生，飞速发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。目前，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成了高新技术产业，社会效益和经济效益巨大。,开发成功的约五十个药品主要应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病、囊纤维变性和一些遗传病上，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化学药物难以达到的作用。每年平均有3-4个新药或疫苗问世，,原因:基因工程制药物的研究与开发多是以对疾病的分子水平上的现有了解为基础的。为什么基因工程制药行业在近二十年中的飞速发展？基础学科的突破：分子遗传、分子生物、分子病理、生物物理等工程学科的高速进展：基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和蛋白质工程等。,基因工程药物的开发时间为5-7年，比开发新化学单体（10-12年）要短一些。这也与各国政府的支持有关。,生产基因工程药物的基本方法,将目的基因连接在体载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，再将目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。基因治疗：目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，但目前尚没有基于基因治疗技术的药物被正式批准。,一些主要的基因工程药物,生物技术产品97年全球销售额5000万美元以上的共有15个红细胞生成素,胰岛素，-干扰素，乙肝疫苗，葡萄脑苷脂酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂，生长激素，Gpllb/IIIa抗体，-la干扰素,-链球菌DNA酶,白介素-2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,增加红/白血球的1个药销售额32.7亿美元,占15个药销售额的45.8%。世界前一百位处方药的行列有三个基因工程药物。,基因工程药物-干扰素,-干扰素有多种亚型，其中最大的一类亚型是-干扰素。-干扰素具有三大功能：抗病毒作用、抗肿瘤作用和免疫调节作用,1）抗病毒作用机理：干扰素是通过抑制病毒复制和调节机体免疫功能，从而发挥抗病毒作用。是迄今为止治疗慢性乙肝的首选抗病毒药物，是治疗丙肝的唯一有效抗病毒药物。对其它多种病毒感染也有效。,2）抗肿瘤作用：-干扰素是临床上应用最广的治疗肿瘤的细胞因子。它通过直接抑制肿瘤细胞增殖和调节机体免疫功能发挥抗肿瘤作用。3）免疫调节作用：-干扰素通过调节机体的免疫功能，从而间接地发挥抗病毒作用和抗肿瘤作用。,意义以往所用的干扰素均是血源性干扰素。血源性干扰素的缺点：病毒污染；纯度低，比活性低，生产成本高。严重地影响了干扰素在临床上的使用价值。,基因工程-干扰素优点：无污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点。基因工程-干扰素的出现，是干扰素研究工作的一项重大突破，它使得-干扰素能进入大规模的产业化生产，从而使-干扰素能够广泛应用于临床，造福于人类。,单克隆抗体技术,（1）单克隆抗体的基本概念（2）单克隆抗体技术的基本原理,单克隆抗体的基本概念,1890年,Behring和北里柴三郎发现了白喉抗毒素,建立了血清疗法.1937年,Tiselius用电泳法分离出丙种()球蛋白,并证明抗体活性主要存在于此蛋白中.1975年，Milstein等首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。SARS,血清疗法,基本概念：抗体是指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白.抗体的产生：它是机体免疫系统受抗原物质刺激后,B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。1960S，发现骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体分子结构类似的球蛋白。,免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构相似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig是化学结构上的概念，抗体是生物学功能上的概念。问题：所有抗体均是Ig，对不对？所有Ig分子都具有抗体活性，对不对？,单克隆抗体的特性及用途,特性:高度特异性、均一性。临床应用：疾病的诊断和治疗诊断：检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断，用同位素标记的单克隆抗体进行肿瘤显像。治疗：器官移植的免疫抑制剂以单克隆抗体为载体的药物对肿瘤定