第五章 目的基因的获取ppt课件

.,.,第五章目的基因的获取,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,.,第一节基因组DNA片段化,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。,酶切,.,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1.优点,2.缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamHI,BamHI,BamHI,gene,.,二、随机片段化,1.限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。,内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,（1）限制性内切酶的选用原则,.,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。,2）6bp的内切酶,平均每44（256）bp一个切点。,随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。,内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（Sau3ABamHI）,5-GGATCC-33-CCTAGG-5,BamHI,5-GATC-33-CTAG-5,Sau3A,(同尾酶),.,2.机械切割法,（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片段。,（2）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片段。,.,1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,第二节化学合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。,.,保护dNTP的3端P和5端OH,（1）原理,1.磷酸二酯法,加入的脱氧单核苷酸,起始脱氧单核苷酸,.,带保护的单核苷酸连接,带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来,.,用酸或碱的脱保护,80%乙酸,.,（2）合成过程,下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合。,.,原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。,2.磷酸三酯法,.,将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！,.,固相磷酸三酯合成过程,固相支持物,结果是全保护的DNA：5DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲基),3固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护,固相支持物,固相支持物,C,.,目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用。,.,3、亚磷酸三酯法,(1)脱二苯甲基保护基加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5OH。,(2)活化新的碱基核苷酸单体2的3端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH用-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。,.,(3)缩合反应在弱强四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3，5磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。,(4)盖帽反应加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1中的5OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。,(5)氧化反应形成的3一5磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。,.,三价,五价,.,如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上洗脱下来，最后除去NH4OH，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。,要注意的问题:合成方向35核苷酸单体的磷酸基团在3端亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。,.,化学合成的DNA片段一般在200bp以内。,二、化学合成DNA片段的组装,用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。,1.互补连接法,预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,（合成的DNA单链的5端是-OH）,.,T4DNA连接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA双链,（3）连接酶连成完整双链,.,2.互补延伸连接法,预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。,3,5,5,3,5,3,T4DNA连接酶,Klenow片段,引物,.,1.直接合成基因,三、寡聚核苷酸化学合成的优点,2.合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA,3.合成探针序列,4.定点突变合成,合成带有定点突变的基因片段。,（2）有些基因比较短，化学合成费用较低,.,DNA合成仪,5.合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性末端某种酶切所产生的粘性末端）。,AATTC,G,GAATTC,CTTAAG,.,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,一、基因文库的构建,1.基因文库（genelibrary）,第三节目的基因的保存和扩增,.,（2）目前常用的载体,2.构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片段数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb,.,断点完全随机，片段长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（1）染色体DNA大片段的制备,3.基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。,物理切割法：,内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片段。,酶切法：,.,（2）载体与基因组DNA大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A与BamHI的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。,.,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,.,.,4.基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-f),p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f:插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组DNA的百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,ln以e为底的对数,.,例如：人的基因组是3109bp，插入DNA片段的平均长度如果是1.7104bp,N=,ln(1-p),ln(1-f),=,ln(1-99%),ln(1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,=8.1105,.,1.cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,2.cDNAlibrary,二、cDNA文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,.,（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。,4.构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（totalRNA）提取,3.cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,.,分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分离纯化,原理,mRNA的分离纯化,Column（柱）,.,.,反转录酶,（3）cDNA的合成,cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,OligodT引物,.,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物,降解mRNA模板,或RNaseH,碱,.,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第二链合成,.,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,.,.,这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片段。,妙用RNaseH,小片段正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片段。,DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,.,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA聚合酶,DNA聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,RNaseH,DNAligase,去引物,.,.,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,5.cDNA与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,.,.,6.cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-),p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）,:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例,N：所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,.,三、文库的查询（screening）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,.,第四节目的基因的分离和扩增,一、从mRNA分离目的基因,1.探针柱分离特异mRNA,根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。,富集特定基因的mRNA或cDNA模板。,.,纤维柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,TotalmRNA,纤维柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,过柱,与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。,特异mRNA,洗脱,RT-PCR,.,2.mRNA消解杂交,原理：,羟基磷灰石柱,结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。,（Hydroxylapatitecolumn）,.,从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟基磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。,.,A,A,A组织,B组织,总mRNA（A）,总mRNA（B）,含蛋白A的mRNA,不含蛋白A的mRNA,总cDNA第一链,A,杂交,内含蛋白A的cDNA,羟基磷灰石柱,过柱,吸收RNA-DNA,单链滤过,羟基磷灰石柱,B,A,cDNA文库,.,3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）,mRNAdifferentialdisplayRT-PCR,（1）3端的锚定引物,Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、GorCN:A、G、TorC,5,3,.,（2）12种锚定引物,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,AA,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,.,（3）5端的随机引物,10mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,扩增cDNA。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,.,（4）随机引物与锚定引物成对扩增,12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,240组在能分出20000多条带！,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,.,（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较,不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。,选择有差异的带，进一步PCR作探针。,筛选文库，找到差别基因的全长序列。,.,二、PCR技术获得目的基因,1.直接从基因组中扩增,（1）提取基因组DNA作模板,（2）根据已知目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增,真核生物基因组含有内含子！,适合扩增原核生物基因。,(一)已知目的基因序列,.,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,.,（1）提取基因组totalRNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据已知目的基因序列设计引物,2.从mRNA中扩增:RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,.,目的基因的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因的引物2,目的基因cDNA第二链,PCR,mRNA,.,(二)未知目的基因序列,（1）反向PCR,扩增两个引物外侧的未知序列,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,.,使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。,.,(2)盒式PCR,盒式PCR（CassettePCR）是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。,.,原理,首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的酶切割，产生含上下游未知区域DNA分子，然后与含有对应限制酶切位点的Cassette进行连接，接着用Cassette引物1（C1）和根据已知区域设计的特异引物1（S1）进行第一次扩增，最后用Cassette引物2（C1）和根据已知区域设计的特异引物2（S2）进行第二次扩增。在设计上Cassette的5端为-OH，所以目的DNA的3末端和Cassette的5末端连接部位形成缺口。因此第一次PCR反应从引物C1开始延伸反应在连接部位终止，控制了非特异性扩增。只有从引物S1延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行扩增反应。再用内侧引物（C2，S2）进一步进行巢式PCR，高效特异地扩增目的DNA未知区域。,.,(3)RACE技术,RACE（RapidAmplificationofcDNAends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5之间的未知序列的方法,分别称为3-RACE或5-RACE。锚定(AnchoredPCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。,.,3-RACE原理,TTTTT-Q1-Q0,5,AAAAA3,QT,TTTTT-Q1-Q0,第一链cDNA,QT,第一次扩增,GSP1,Q0,第二次扩增,Q1,GSP2,反转录,图经典3-RACE,.,5-RACE原理,第一链cDNA,5,3,ORF,GSP-RT,GSP-RT,逆转录,cDNA加尾,第一链cDNA,GSP-RT,AAAA,第一次扩增,Q1-TTTT,AAAA,第二次扩增,Q1,图经典5-RACE,GSP1,GSP2,.,高特异性的5-RACE原理,高特异性的RACE基于反向PCR扩增技术,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩增的原理，故具有较高的特异性。,AAAAAA3,已知序列,Pi5端磷酸化特异引物,逆转录,AAAAAA3,已知序列,RNaseH降解掉mRNA,T4RNALigase环化单链cDNA,A2A1,S1S2,PCR1,A1、S1,PCR2,S2、A2,.,三、转座子标签法,转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。,原理,转座子插入,基因失活或突变,构建纯合突变株基因组文库,转座子为探针,筛选出包含目的基因片段的阳性克隆,目的基因片段为探针,筛选野生型的植株构建的基因组文库,测序,.,目的基因标签法,转座子,导入,(含转座子的显性纯合体)AA*,（隐性纯合体）aa,(显性表型)Aa,（突变或隐性表型）A*a,自交,aa,A*a,（突变纯合子）A*A*,建基因文库,目的基因对应的显性隐性性状个体都有,.,非目的基因标签法,转座子,导入,(含转座子的显性纯合体)AA*,（显性纯合体）AA,（突变或显性表型）A*A,自交,AA,A*A,（突变纯合子）A*A*,建基因文库,（显性纯合体）AA,关注的是一群因转座子插入引起突变的性状的基因，目的是筛选于某一性状相关的几个基因,.,转座子探针,转座子标签法流程图,突变纯合子基因文库,转座子,目的片段,亚克隆,PCR获得全长基因,筛选,野生型植株基因文库,全长目的基因,.,四、图位克隆法,图位克隆：根据目的基因在基因组上的位置特性而不是其编码产物来进行基因克隆。,基因定位的基本步骤：1、通过DNA连锁分析、染色体缺失或平衡易位等方法将目的基因或其突变定位到染色体上。2、在目的基因的一侧或两侧确定一条或两条紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记，也可以是已知序列基因片段，两者统称为DNA分子标记。3、利用紧密连锁的分子标记序列作探针，通过染色体步移、染色体登陆等技术逐步逼近并最终将目的基因分离出来。,.,1、染色体步移,染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。,.,筛选,已知的分子标记基因,未知的目的基因,350kb,YAC基因组文库,分子标记探针,筛选,阳性克隆a,探针a,探针b,阳性克隆b,重复筛选直到获得目的基因,含目的基因的克隆,图染色体步移筛选目的基因,.,2、染色体登陆,如基因组文库的平均插入片段的长度大于目的基因与已知分子标记的物理距离，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移，这种方法称为染色体登陆。,染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。,.,分子标记Marker,目的基因Targetgene,100kb,探针,基因组文库,插入DNA100kb,阳性克隆,进一步证实,目的基因,图染色体登陆筛选目的基因,.,第五节酵母双杂交系统,YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap),90年代，纽约大学的S.Field等建立。,.,有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质,二、酵母双杂交系统的原理,许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。,1.结构域（Domain）合作,一、酵母双杂交系统的作用,.,例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:,DNAbindingdomain,Activedomain,N,C,1-147aa,768-881aa,上游激活序列（UAS）,转录机,GAL4效应基因,结合,结合,激活转录,只要DNAbindingdomain（DNA-BD）与Activedomain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。,实验发现：,转录表达,.,2.拆开Domain,DNAbindingdomain,Activedomain,上游激活序列（UAS）,转录机,GAL4效应基因,结合,用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。,不能转录,.,3.重组Domain,用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。,Activedomain,蛋白A,蛋白B,DNAbindingdomain,在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。,通过效应基因是否被激活来检查：,4.观察报告基因表达,.,上游激活序列（UAS）,转录机,GAL4效应基因,蛋白A,DNAbindingdomain,转录激活domain,蛋白B,GAL4的DBdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。,不能转录,（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合,.,上游激活序列（UAS）,转录机,GAL4效应基因,蛋白A,DNAbindingdomain,转录激活domain,蛋白B,激活转录,GAL4的DBdomain与ADDomain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。,转录表达,（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合,.,双杂交原理,X基因和Y基因产物的相互结合，导致reportergene表达。,Reportergene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。,.,三、构建双杂交体系的宿主菌,删除基因组中的内源野生型GAL4基因,使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。,如：SFY526;HF7c等菌株。,四、构建报告基因（reportergene）,GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。,GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。,此外还有其他营养缺陷。,.,1.穿梭质粒（shuttleplasmid）,五、构建双杂交体系的穿梭质粒,既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。,2.双杂交体系需要两种穿梭质粒,分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。,.,靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。,（1）BD-plasmid,P:ADH1启动子。T:ADH1终止子。,筛选标志：TRP,核定位信号是GAL4本身的一部分,ADH：Alcoholdehydrogenase,.,（2）AD-plasmid,外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片段之后。,P:ADHI启动子。T:ADHI终止子。,筛选标志：LEU2,核定位信号是SV40的T抗原的序列,.,六、酵母双杂交的实验过程,1.把蛋白A插入到BD质粒上（pG