分析化学第五版下册-第8章分子发光分析法分解.ppt

第8章分子发光分析法,8.1概论,8.1.1分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法,分子在退激过程中以光辐射形式释放能量,8.1.2分子分析法的特点,1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强灵敏度荧光分析法比分光光度法高23个数量级2.选择性好选择不同的激发光波长选择不同的检测荧光波长3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广,8.2分析荧光与磷光光谱分析法,8.2.1基本原理8.2.1.1荧光、磷光产生的机理,基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。M+能量M*M+热量M+h分子吸收了光能而被激发，跃迁至振动能级的三重态或单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。M+hM*M+h荧光和磷光属于光致发光。,1、荧光、磷光的产生,依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子发光属于分子发射光谱的范畴，光发射过程涉及分子内部电子能级的跃迁。基态(S0)激发态(S1、S2.)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式,速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。第一、第二、电子激发单重态S1、S2；第一、第二、电子激发三重态T1、T2。,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)。平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），因此，在同一激发态中，三重态能级比相应单重态能级低。大多数有机分子的基态处于单重态。,S0T1禁阻跃迁；通过其他途径(系间跨越)；进入的几率小。,外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,3.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁(热)等方式失去能量。,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s,第一激发三重态的最低振动能级基态。,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级(为S1S0跃迁)，发射波长为2的荧光；发射时间约为10-710-9s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态各振动能级(T1S0跃迁)。发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。电子由S0进入T1的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）S0激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫T1,2.荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命（）指的是荧光分子处于激发态的平均寿命，可用下式表示：,式中表示荧光分子发射过程的速度常数，代表各种分子内的非辐射衰变过程的速度常数的总和。,（一）荧光效率荧光强度常用荧光量子效率f来描述荧光量子效率f=,f是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，f越大，荧光越强，在01之间,Kf为荧光发射过程的速率常数取决于物质的化学结构。K为非辐射跃迁的速率常数之和主要取决于化学环境，也与化学结构有关。分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0.11之间。,磷光的量子产率p与荧光量子产率p相似。,8.2.1.2荧光磷光与有机化合物结构的关系物质只有吸收了紫外可见光，发生*,n*跃迁，产生荧光*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102103，寿命短*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光,1.共轭键系统具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强,f,ex/nmem/nm,0.11205278,0.29286310,0.46365400,苯,萘,蒽,350,菲,线状环结构比非线状结构的荧光波长长,2.刚性平面结构较稳定的平面结构,具有强荧光的分子多数有刚性平面结构,荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质,酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质,（4）取代基效应（实验总结和推测）：取代基的性质(尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。,给电子取代基使荧光加强供电子基团的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN等。,取代基的影响主要有以下几个方面：,吸电子基团使荧光减弱而磷光增强属于这类基团的为吸电子基团：如羰基(-COOH，-CHO)，硝基(NO2)及重氮基等。,取代基位置的影响取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者通常抑制荧光。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。,5.最低电子激发单重态的性质,含N、O、S杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对n电子，电子跃迁多为n*，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。不含N、O、S杂原子的有机荧光体多发生*类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为104，荧光强。,8.2.1.3影响分子发光的环境因素,1.溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大,2.介质的温度和黏度的影响低温下测定，提高灵敏度大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大介质黏度的提高，有利于提高荧光或磷光的强度。,3.pH的影响,大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。,6,pH1有荧光,pH13无荧光,无荧光,有荧光,另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性,8.2.1.4荧光、磷光猝灭,荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。,（1）碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。,激发单重态的荧光分子,猝灭剂分子,生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。,（2）生成化合物的猝灭,基态的荧光物质,猝灭剂,（3）氧的猝灭,O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。,（4）.荧光物质的自吸猝灭,当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。,自猝灭可能有如下几个原因：(1)荧光物质分子之间的碰撞能量损失;(2)荧光物质的自吸收;(3)荧光物质分子的缔合。,8.2.1.5荧光激发光谱与发射光谱,荧光：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光的激发光谱曲线以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强处测量荧光强度，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制的关系曲线。与吸收光谱曲线形状相同。,2.荧光发射光谱,固定激发光波长(选最大激发波长)和强度，化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。荧光激发光谱与发射光谱是测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用于鉴别物质。,3.激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。,8.2.1.6荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系,用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系。,Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度,If=f（I0-I010-A）=fI0（1-10-A）,I=I010-A,将上式展开,If=fIa=f（I0-I）,当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3fI0A=2.3fI0cL,当A0.05时，If与f、I0、和c有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、和L为常数，合并为KIf=KcIp=Kc,定量分析依据,荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=Kc只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。浓度高时，If与c不呈线性关系，有时c增大，If反而降低。因为公式中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。,If=Kc,浓度效应包括：1.内滤效应2.发光分子形成基态或激发态的聚合物3.发光的再吸收,8.2.2荧光、磷光分析仪器,8.2.2.1荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,荧光光度计仪器光路图,1.光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见-紫外区),光源要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命,高压汞灯:是以汞蒸气放电发光的光源，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。氙灯:是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，具有光强度大，在200800nm范围内是连续光源的特点。染料激光器:是一种新型的荧光激发光源。,I0,It,IF,p,4.检测器：,现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。,3.样品池：,荧光分光光度计的样品池四面透光。,2.单色器：荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器。,5.读数装置,8.2.2.2磷光分析仪器,1、试样池低温磷光一般在液氮温度下进行，盛放试样的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。2、磷光镜,通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。,8.2.3荧光的常规测定方法1.直接测定法2.间接测定法（1）荧光衍生法（2）荧光猝灭法（3）敏化荧光法3.多组分混合物的荧光分析,8.2.4磷光的测定方法8.2.4.1低温磷光分析8.2.4.2室温磷光分析(RTP)（1）固体基质表面室温磷光分析(SS-RTP)（2）胶束稳定的室温磷光分析（MS-RTP）（3）敏化室温磷光分析（S-RTP）,8.2.5荧光、磷光分析法的应用,荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1.无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。,能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体。荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+等。,2.有机化合物的分析,脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃荧光分析法是最主要的测定方法。为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定。,能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析。固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。,8.3化学发光分析法,8.3.1概述化学发光是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法。化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同化学发光：需要化学反应过程中所提供的化学能激发而发光荧光：光源激发而发光,化学发光分析具有以下特点,灵敏度高例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至210-17molL-1ATP线性范围宽一般有56个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究,8.3.2基本原理,（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A+BC*+D产物接受反应能被激发在可见光区观察化学发光，需170300kJmol-1激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中。2.处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态C*C+h,（二）化学发光效率和发光强度,化学发光效率CL,激发态分子的化学效率,激发态分子的发光效率,r取决于发光所依据的化学反应本身f与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。,化学发光强度,具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。非生物体的化学发光效率一般不超过1%化学发光强度ICL（t）与反应速度、化学发光效率有如下关系,ICL随时间和反应物的消耗逐渐减小,A+BC*+DA为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应,t时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。根据已知时间内的发光总强度来定量分析。,发光总强度,8.3.3化学发光反应的类型,8.3.3.1气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应NO+O3NO2*NO2*NO2+h发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应O3O2+O（1000C石英管中进行）SO2+O+OSO2*+O2SO2*SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,（2）火焰化学发光,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮NO+HHNO*HNO*HNO+h发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：690n