第8章-基因突变与人工创造突变体发学生.ppt

不同皮色的老鼠,各种白化动物,畸形儿，谁之过？,受橙剂后遗症危害的越南民众图片来自,8.1基因突变的一般特征8.2基因突变与性状表现8.3基因突变的鉴定8.4基因突变的分子基础8.5人工创造突变体,第八章基因突变与人工创造突变体,孟德尔遗传以及连锁遗传中论述的可遗传变异均是由于基因重组的结果，不是基因本身发生了质的变化。如：黄子叶、园粒绿子叶、皱粒黄、园；黄、皱；绿、园；绿、皱本章讨论染色体上基因发生改变。,8.1基因突变的一般特征,基因突变的概念自发突变的随机性和不定向性基因突变的可逆性和重演性基因突变的多方向性和复等位基因基因突变的有害性和有利性基因突变的平行性,基因突变的概念基因突变：（genemutation）是指基因的核苷酸序列（包括编码序列及其调控序列）发生了改变。也称点突变（pointmutation）广义的突变包括基因突变和染色体畸变，狭义的突变仅指基因突变。DeVries首先提出“突变”一词1910年MorganTH首先在果蝇中发现基因突变1927年MullerHJ首次用X射线诱发了基因突变,几个专业术语（自学弄清其定义，见注释）点突变（pointmutation）同义突变（synonymousmutation）错义突变（missensemutation）无义突变（nonsensemutation）移码突变（frameshiftmutation）无效突变（nullmutation）碱基转换（transition）碱基颠换（transversion）碱基插入/缺失（insertionanddeletion,合称indel）,突变率和突变频率突变率（mutationrate）：单位时间内（如一个生物世代或细胞世代内）某一基因突变发生的概率。突变频率（mutationfrequency）：指突变体在一个世代群体中所占的比例。,突变体（mutant）或称突变型:指带有突变（或改变的）基因的细胞或个体。其对应基因未改变的细胞或个体则称为野生型（wildtype）,突变频率的估算因生物的生殖方式而不同有性生殖生物：用配子发生突变的概率，即用一定数目配子中的突变配子数表示。细菌和单细胞生物：用细胞发生突变的概率，即用一定数目细胞中突变细胞数表示。,突变率难以准确测定，一般用突变频率估算突变率。,高等生物中的自发突变率一般为10-10-10-5，即在10万到1亿个配子中可能有一个突变发生。玉米、果蝇、人：自发突变率为10-6-10-5，即在10万至100万个配子中只有一个发生突变，可见自然突变的频率很低。老鼠：自发突变率10-5-10-4,基因自发突变的稀有性,大肠杆菌基因自发突变率：链霉素抗性基因strR为410-10乳糖发酵基因lac-为210-7病毒与细菌基因平均自发突变率为10-8,基因突变的时期时期在任何时期都可发生，即体细胞和性细胞都能发生突变。基因突变通常是独立发生的。体细胞和性细胞突变频率性细胞的突变频率比体细胞高，这是因为性细胞在减数分裂末期对外界环境条件具有较大的敏感性。,性细胞和体细胞突变的传递与表现性细胞如果是显性突变aaAa，可通过受精过程传递给后代，并立即表现出来。如果是隐性突变AAAa，当代不表现，只有等到第二代突变基因处于纯合状态才能表现出来。,体细胞显性突变，当代表现，同原来性状并存，形成镶合体。突变越早，范围越大，反之越小。果树上许多“芽变”就是体细胞突变引起的，一旦发现要及时扦插、嫁接或组培加以繁殖保留。“芽变”在育种上很重要，有不少新品种是通过芽变选育出来的，如温州早桔就是源于温州密桔的芽变。,一、基因突变具有随机性和不定向性自发突变自发突变（spontaneousmutation）是在无人工干预条件下，自然发生的基因突变。自发突变具有不定向而且是随机发生的特征。突变是不定向的，随机的，只有选择才是定向的，群体中某基因的定向改变是由特定的选择因素的作用造成的，并非生物体的定向变异的结果。例如，细菌的抗性突变与所接触的抗生素药物或噬菌体无关，药物或噬菌体只是以一种自发突变体的选择因子在起作用。,二、突变的重演性和可逆性重演性同一突变可以在同种生物的不同个体间多次发生，称突变的重演性。下表列举玉米子粒的7个基因的前6个在多次试验中都出现过类似的突变。,玉米籽粒7个基因的自然突变频率（Stadler，1942）,重演性,野生型wildtype突变型mutant,可逆性,正向突变突变率uForwordmutation,回复突变突变率vBackmutation,课本p107的提法：正突变率总是高于反突变率，即uv。对吗？正向突变：野生型突变型，概率=u回复突变：野生型突变型野生型，概率=uv正确说法：野生型自发突变为某个突变型的概率该种突变型回复为野生型的概率。实际上u和v之间应该差别不大。,三、突变的多方向性和复等位基因多方向性Aa，Aa1，Aa2，复等位基因multiplealleles定义：位于同一基因座位上的3个或3个以上的基因称为复等位基因。,如上，A、a1、a2、an彼此组成一对等位基因，它们全体组成复等位基因。,复等位基因存在于同一类型的不同个体里如AA，Aa1，a2a3，aman举例：烟草自交不亲和性有15个复等位基因：S1,S2,S15,复等位基因例子人类的ABO血型遗传三个等位基因IA、IB、iIA、IB对i为显性，IA和IB为共显性关系，可各自发生作用，组成6种基因型和4种表现型表现型（血型）基因型AIAIA，IAiBIBIB，IBiABIAIBOii,四、突变的有害性和有利性有害性大多数是有害的致死突变lethalmutation例：植物的白化突变绿株WW绿株Ww1WW:2Ww:1ww3绿苗:1白苗(死亡),多数为隐性致死（recessivelethal）少数为显性致死（dominantlethal）伴性致死（sex-linkedlethal）即致死突变发生在性染色体上。,中性突变neutralmutation控制一些次要性状基因，即使发生突变，也不会影响生物的正常生理活动，因而仍能保持其正常的生活力和繁殖力，为自然选择保留下来。称为中性突变，如水稻芒的有无、籽粒颜色等。,突变的有害有利性的相对性突变的有害性是相对的，在一定条件下可以转化，如矮杆突变体：刚开始出现时在群体中呈劣势；但育成品种后在高肥、多风条件下种植则具有竞争优势昆虫残翅突变体：一般条件下有害突变；在多风海岛却可避免被飓风刮走而利于生存,五、突变的平行性定义亲缘关系相近的物种因遗传基础比较近似，往往发生相似的基因突变，称突变的平行性。意义当了解到一个物种或属内具有那些变异类型，就能预见近缘的其他物种或属也同样存在相似的变异类型。,8.2基因突变与性状表现,一、显性突变和隐性突变的表现显性突变表现早纯合慢，当代（第一代）就能表现，第二代能纯合，而检出纯合突变体则需到第三代。,体细胞显性突变，当代为嵌合体，要选出纯合体，须通过有性繁殖自交两代。,显性突变的表现,第1代（M1）,第2代（M2）,第3代（M3）,显性突变发生,自交,自交,DD1DD:2Dd:1dddd,1DD：2Dd:1dd,Dd,dd,隐性突变表现晚纯合快，第二代表现，第二代纯合并可检出,第1代（M1）,第2代（M2）,隐性突变发生,自交,1DD：2Dd:1dd,Dd,DD,隐性突变的表现,体细胞隐性突变，当代不表现，要使其表现只需有性繁殖自交一代。突变的表现与植物繁殖方式自花授粉作物，只要自交即可分离出来。异花授粉作物，要进行人工自交或互交，否则长期保持异质。,二、大突变和微突变的表现大突变macromutation突变效应表现明显，容易识别。质量性状突变大都属此,微突变micromutation效应表现微小，较难察觉。数量性状的突变属之。微突变可以积累大的变化微突变中出现的有利突变大突变。所以在育种工作中要特别注意微突变的分析和选择，在注意大突变的同时，也应重视微突变。,8.3基因突变的鉴定,突变发生的鉴定是否真实的基因突变？是显性还是隐性突变？突变频率？基因发生某种化学变化而引起的变异：可遗传环境条件导致的变异：不遗传,一、植物基因突变的鉴定,例：高秆矮秆，其原因：基因突变而引起；因土壤瘠薄或遭受病虫为害而生长不良等。鉴定方法：可将变异体与原始亲本在同一栽培条件下比较。高秆矮秆后代为高秆，则不是突变，由环境引起；,自交,后代仍为矮秆，则是基因突变引起的。,显隐性的鉴定显性突变和隐性突变的区分，可利用杂交试验鉴定如：突变体矮秆株原始品种(高)F1高秆自交F2高秆、矮秆分离说明该突变属于隐性突变,突变率的测定花粉直感(胚乳直感）法估算配子的突变率举例：测定玉米籽粒由Susu的突变率。利用甜粒玉米susu为母本、诱变处理的非甜玉米SuSu为父本进行杂交，理论上F1果穗上都应为非甜，但2万粒中却出现个别甜粒（2粒），这说明父本的2万粒花粉中有2粒花粉的基因由Susu，说明基因Su的突变率为万分之一。,花粉直感：两个相异的植株杂交，当代所结籽粒即表现父本性状的现象。其原因是参与受精的花粉中带有控制胚乳性状的显性基因。,植株测定法根据M2出现的突变体占观察总个体数的比例来估算。如M2群体中10万个观察个体数中出现5个突变体，突变率为0.005%。,二、真菌生化突变的鉴定,（一）红色面包霉的生化突变型几个基本概念生化突变：由于诱变因素的影响导致生物代谢功能的变异。营养缺陷型（auxotroph）:诱变导致生物丧失了合成某种生活物质的能力，需在特定的营养下才能生长。野生型或原养型（prototroph）,基本培养基：野生型可在这种培养基因生长。水+无机盐(硫酸盐、硝酸盐等)+糖类(葡萄糖或蔗糖)+微量生物素(VB的一种)。完全培养基：各种突变型可以在这种培养基生长。基本培养基+多种氨基酸+多种维生素红色面包霉的突变型：红色面包霉合成其生活所需物质一系列生化过程每一过程由一定的基因所控制。只要综合分析大量的生化突变资料可阐明有关基因的功能及其作用的程序。,Beadle红色面包霉的生化突变型野生型：基本培养基上可生长突变型(a)：基本培养基+精氨酸可生长突变型(c)：基本培养基+瓜氨酸(精氨酸)可生长突变型(o)：基本培养基+鸟氨酸(精或瓜)可生长图中表示不添加某物质，表示不能生长，表示在添加某物质的培养基上可生长,根据以上实验，可以推论精氨酸的合成步骤为：前体鸟氨酸瓜氨酸精氨酸蛋白质由此可以看出，从鸟精的合成至少需要A、C、O三个基因，其中一个基因发生突变，精氨酸是不会合成的，这个实验证明了基因与新陈代谢的关系。Beadle1941年根据这个实验研究，阐明基因是通过酶的作用来控制性状的，于是提出“一个基因一个酶”的假说，把基因与性状两者联系起来。,前体,精氨酸蛋白质,瓜氨酸,鸟氨酸,（二）红色面包霉生化突变的鉴定方法图片引自KlugandCummings，2002,8.4基因突变的分子基础,自发突变的原因：A.复制错误B.碱基的异构体互变效应C.转座因子的插入D.自发的化学变化：脱嘌呤、脱氨基、生物体内活性氧化剂对DNA的氧化损伤诱变因素：A.化学诱变B.物理诱变C.生物学诱变,一、突变的分子机制（一）位点与基因座位点（site）：指DNA（基因）上的一个核苷酸对。一个基因内不同位点的改变可以形成许多等位基因（复等位基因）。基因座（locus）：指一个基因，包括数百个数千个核苷酸对。一个基因座上的复等位基因是基因内部不同碱基改变的结果。,（二）突变的方式（1）分子结构的改变碱基替换：如AAA（赖）GAA（谷）。包括：转换:transition,嘌呤与嘌呤或嘧啶与嘧啶之间的转换颠换:transversion,嘌呤转换为嘧啶或嘧啶转换为嘌呤（2）移码frameshift碱基缺失移码：如AAA（赖）CAC（组）AAC（天）AC碱基插入移码：如AAA(赖)AAC（天冬酰胺）A,镰刀型贫血症与点突变,正常红细胞基因型HbAHbA,镰刀型红细胞基因型HbSHbS,人的血红蛋白由2条链和2条链组成。镰刀型贫血症患者的链第6位的Glutamicacid变成了Valine。谷氨酸的密码子为GAA或GAG，而缬氨酸的密码子为GUU、GUC、GUA、GUG。中间1个碱基的替换导致了1个氨基酸的改变，从而导致了镰刀型贫血症。,THECATSAWTHEDOG?,图片引自KlugandCummings，2002,移码突变,（三）自发突变的机制（1）自发损伤常见的有脱嘌呤和脱氨基作用。一个哺乳动物细胞在37培养20h的细胞复制周期中，DNA自发地脱落大约10000个嘌呤碱基。（2）碱基的氧化损伤活性氧化物，如超氧自由基(O2)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH)都被认为是正常有氧代谢的副产物，这些副产物对DNA产生氧化损伤，不仅能对DNA的前体造成氧化性损伤，从而引起突变，而且会引发多种人类疾病。（3）DNA复制错误碱基异构体转换会导致DNA复制错误，造成碱基替换；复制滑动可导致碱基插入、缺失，造成移码突变。（4）其他可能的机制自然界存在的辐射；温度急剧变化导致DNA复制酶的保真性降低；重复序列引起的复制滑动（replicationslippage）,碱基,嘧啶环,嘌呤环,异构体互变会改变碱基配对性质并导致突变,碱基异构体互变（Tautomericshifts）,二、突变的修复(自学)1、DNA防护机制（1）简并密码子（2）回复突变（3）抑制（4）致死和选择（5）多倍性,2、DNA的修复（1）光修复（2）暗修复（3）重组修复（4）SOS修复,未雨绸缪坏了就修！（自学）,想变就变理化诱变想变什么就变什么生物学诱变想在哪变就在哪变CRISPR-Cas9定点编辑,8.5人工创造突变体,一、突变体的用途,太空辐射育种,突变体的用途育种,突变体的用途遗传与发育机理的揭示,例如：THMorgan通过研究果蝇白眼突变体揭示了性连锁遗传规律CNsslein-Volhard，EWieschaus,EBLweis等人通过研究大量果蝇和斑马鱼胚胎突变体，提出了由间隙基因、成对基因、节段极性基因、同形异位（同源异形）基因控制发育的模式,Legsonhead?!,Fourwings?!,Oh!Tellmewhatisright!,Wildtype,mutant,HOXD13mutation,果蝇体节分化,a:受精后约10h的果蝇胚,控制果蝇身体结构建成的基因,Maternal-effectgenes(40genes)Segmentationgenesgapgenespair-rulegenessegmentpolaritygenesSelectorgenes,Zygoticgenes(5060genes),Howtorealizethebodyplan?,a母性效应基因控制胚沿着前后轴向形成物质分布梯度b合子间隔基因将胚胎粗分为3个大的区域（大致对应于头、胸、腹三部分）打轮廓c合子对控基因进一步将胚胎划分为大约2节宽的条带；所有成对基因的相互作用决定节段的边界画草图d合子体节极性基因将每个节细分为前后两半描细节e同源异型选择基因决定每个体节的特性或命运,例如：GWBeadle和ELTatum以红色面包酶为材料，根据对生化突变体的研究提出“一个基因一个酶”假说。认为生物体内发生的每一步代谢反应，都是由一种特殊的酶负责控制的，而这种酶又是某一特定基因的合成产物。,突变体的用途生化途径的揭示,突变体的用途遗传疾病的研究,沙皇尼古拉二世之子：血友病,维多利亚女王：血友病突变基因携带者,正向遗传学策略（forwardgeneticsstrategy）克隆已知突变表型或功能的基因，再分析其序列，即由功能序列。只能分析单个的或少数的基因，所获得的信息是零散而片面的逆向遗传学策略（reversegeneticsstrategy）从大规模的已知DNA序列出发，对基因组的基因进行功能敲除（knock-out）或激活(knock-on),获得大量突变体，并系统地分析其功能。即由大规模序列功能。所获得的信息是系统的、完整的,突变体的用途基因功能分析与功能基因组学研究,二、人工创造突变体的方法,获得突变体的途径最终可归结为：破坏基因结构改变基因表达诱变方法：物理诱变(physicalmutagenesis)化学诱变(chemicalmutagenesis)生物学诱变(biologicalmutagenesis),（一）物理诱变,物理诱变因素,电离诱变因素,非电离诱变因素,电磁辐射,粒子辐射,紫外线,X射线射线,带电粒子不带电粒子,射线射线质子中子,电磁波谱的组成及其波长,能量高于可见光的射线对生物体有害,(1)电离辐射诱变包括射线、射线和中子等粒子辐射，还包括射线和X射线等电磁波辐射。中子的诱变效果最好。根据辐射（照射）的方法，可分为“内”和“外”照射。,外照射即辐射源与接受照射的物体之间要保持一定的距离，让射线从物体之外透入物体之内，在体内诱发基因突变。X射线、射线和中子都适用于“外照射”。内照射即用浸泡或注射的方法，使其渗入生物体内，在体内放出射线进行诱变。,和射线的穿透力很弱，故只能用“内照射”。实际应用时，一般不用射线，只用射线。射线常用辐射源是P32和S35，尤以P32使用较多电离辐射诱变的机理照射初级电离次级电离基因分子结构改组基因突变或染色体结构变异,辐射剂量及表示方法定义：单位质量被照射的物质所吸收的能量数值，称为辐射剂量。X射线和射线：用“伦琴”（r）表示，即在1克空气中吸收8310-7焦耳（J）辐射的能量。中子：单位是“积分流量”。即每平方厘米的截面上通过的中子数（n/cm2）。射线：用“微居里”表示。具体是每克物质吸收多少“微居里”（cu）的放射性同位素。微居里是放射强度单位，表示每秒钟有3.7104个原子核发生蜕变。,基因突变的频率与辐射剂量成正比，即剂量增加一倍，突变频率增加一倍，但突变率不受辐射强度的影响。辐射强度是指单位时间内照射的剂量数，即剂量率，倘若照射剂量不变，不管单位时间内所照射是多还是少，基因突变率总是保持一致。,(2)非电离辐射诱变种类：UV作用机理激发作用DNA结构改变配对差错突变最有效的诱变波长：260nm适用UV能量较低、穿透力较弱，适于微生物、生殖细胞的诱变,UV照射DNA上的胸腺嘧啶环共价交联形成胸腺嘧啶二聚体DNA构像改变，抑制复制错配,“Childrenofthenight”,阳光中的UV可导致DNA形成thyminedimer（胸腺嘧啶二聚体），正常人含有NER修复系统，可以切除修复受影响的DNA。但干皮病患者丧失了NER功能，所以暴露于阳光中会导致皮肤受损、甚至长肿瘤（如图中男孩的鼻子上就有2个）。如果这种孩子从小就不暴露在阳光中，皮肤受损可以减轻（图中女孩）,简史1941年Auerbach和Robson第一次发现芥子气（mustardgas,一种烷化剂）可以诱发基因突变。1943年Oehlkers第一次发现氨基甲酸乙酯(NH2COO2H5）可以诱发染色体结构的变异。,（二）化学诱变,化学诱变的特点某些化学药物的诱变作用是有特异性的，即一定性质的药物能够诱发一定类型的变异。,化学诱变剂的种类,碱基类似物具有配对两重性，DNA复制时如错误掺入碱基类似物可造成碱基的转换（basetransition）碱基修饰剂对碱基某些基团进行化学修饰从而改变碱基的配对性质，造成碱基的转换或颠换(transversion)DNA嵌入剂可嵌入DNA的碱基对之间，造成复制错误，形成碱基插入/缺失,导致移码突变,碱基类似物：baseanalogsDNA复制时错误掺入到DNA分子中，引起碱基配对错误，造成碱基替换5溴尿嘧啶（5-BU,5-bromouracil）2氨基嘌呤（2-AP,2-aminopurine）碱基修饰剂：对碱基进行修饰使其性质发生改变，引起特异性错配，造成碱基替换亚硝酸（HNO2）：使碱基脱氨羟胺（HA）：使碱基的氨基氮羟基化甲基磺酸乙酯（EMS，烷化剂）：使碱基烷基化嵌合剂：吖啶类染料。含有吖啶环，是一种平面分子，分子大小与碱基对大小相似，可以插入到DNA双螺旋双链或单链的两个相邻碱基之间，造成碱基插入或缺失，引起移码突变。某些抗菌素、叠氮化合物也有诱变效应,碱基类似物具有配对两重性，导致碱基转换突变,5-BU酮式,5-BU烯醇式,酮式与A配对,烯醇式与G配对,5-BU，5-溴尿嘧啶，是T的类似物，但可以和A或G配对,T,烷化剂EMS对碱基的修饰导致其配对性质改变,DNA修饰烷化剂是极强的化学诱变剂。如乙基甲磺酸（EMS）和亚硝基胍（NTG），可对碱基进行烷基化，改变其配对性质，造成碱基替换。DNA嵌入剂，如原黄素素(proflavin),吖啶橙(acridine)等扁平分子可以嵌入DNA的碱基对之间，导致单核苷酸对的插入/缺失，引起移码突变。,（三）生物学诱变,生物学诱变,T-DNAtaggingTransposontaggingRNAinterference定点突变CRISPR-Cas9系统,T-DNAtaggingT-DNA标签法,利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA作为诱变因子,将其插入植物基因组，造成基因的插入突变（insertionalmutation）突变性状与T-DNA的共分离关系的确定插入点旁侧的基因组序列分析以旁侧序列为探针筛选基因组文库，获取全长基因。或直接将序列与网上公共数据库比对，获取相关信息。,GeneA,T-DNA,基因组文库或数据库中含geneA的克隆,Ge,neA,Ge,neA,T-DNA插入突变,插入点旁侧序列扩增、测序,筛选文库或与公共数据库进行序列比对,Ge,neA,目标片段与NCBI公共数据库的序列比对结果,数据库中同源序列,待查目标序列,同源程度指示,网址：/Blast.cgi,基因组序列,预测基因,利用ricegaas数据库搜索水稻预测基因,网址：http:/ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb/,此基因放大见下图,上图第17号预测基因,外显子exon,内含子intron,预测基因氨基酸编码产物的保守区段,转座因子会跳舞的基因？,转座因子定义：指可以在染色体组内移动的特定DNA片段。发现：Emerson（1914）花斑果皮McClintock转座因子的遗传基础,Transposontagging转座子标签法,巴巴拉麦克林托克,BarbaraMcClintock（1902-1992）是20世纪具有传奇般经历的女科学家，她在玉米中发现了“会跳舞”的基因。面对荣获贝尔奖（1983年）这一崇高荣誉，麦克林托克平静地说：“我觉得自己获得这种意外的奖赏似乎有些过分。多少年来，我在对于玉米遗传的研究中已获得很多的欢乐。我不过是请求玉米帮助我解决一些特殊的问题，并倾听了她那奇妙的回答。”,AcDs转座系统造成玉米籽粒颜色的改变,引自KlugandCummings，2002,C,Ds,Ac,Insertionalmutation,Ac,C,Ac,Ds,当Ac存在时，Ds可发生转座,当Ds转座插入基因C时，造成插入失活，籽粒无色,当Ds从基因C切离时，回复野生型，表现有色。由于发生切离的时间不同、发生切离的细胞有限，所以籽粒颜色表现为少量色斑,C为显性基因，使玉米籽粒呈现颜色,Ac因子：activator，是自主成分，具备自身切除和转座的能力。带有2个与转座有关的基因Ds因子：dissociation,非自主成分，只有在同一自主成分Ac存在时才能切除或转座。,Transposontagging的步骤,将转座成分（transposableelement）导入植物。转座成分的插入可造成基因失活诱导转座子在转化体内不断转座，以形成一个不断扩大的插入突变群体确定突变性状与转座子的共分离关系插入点旁侧基因组序列的分析以旁侧序列为探针筛选基因组文库，获取全长基因。或直接将序列与网上公共数据库比对，获取相关信息。,T-DNAtagging与transposontagging的区别,T-DNAtagging：一旦整合在基因组的某个位置后，T-DNA就不能再改变自身的位置，所以要想获得更多的突变体就必须大量转化transposontagging：只要将转座子导入了基因组，经诱导，转座子就可在转化体内不断发生转座，突变群体会不断扩大，因而无需做大量的转化工作,RNAinterference(RNA