赵映方

1,人工诱导龙血竭龙血素B含量的测定,学 院 中 药 学 院 学生姓名 李 伟 专 业 中药资源与开发 实习单位 广东石岐制药有限公司 导师姓名 马 元 英,2,人工诱导龙血竭龙血素B含量的测定,主要内容,前言试验研究讨论致谢,3,前言,龙血竭为传统名贵中药,主要在明清以前使用。明清后使用主要为棕榈科龙血树所产血竭又名麒麟竭、竭留、海蜡等,是中医常用的活血散淤和止血药,其性平,味甘、温、咸, 平，归心、肝经，具有良好的活血散淤、定痛止血、生肌敛疮等功效,主要用于外伤出血、溃疡不敛、跌打损伤、淤滞等症,有“活血之圣药”的美誉(明李时珍本草纲目卷34)。,4,前言,龙血竭（Dragons blood）主要来源于龙舌兰科(现合并到百合科)龙血树属或其它科属植物的树脂，是龙血树树干受到损伤后，在一定的生态条件下，经微生物浸染，发生生理生化转化，使内皮层和髓部逐渐转变为红色树脂。龙血竭的形成是龙血树对外界因子胁迫和刺激作用的积极响应，是一个以次生代谢产物为分子基础的复杂的生理生态过程。目前龙血竭的运用越来越广泛，特别是在治疗冠心病、脑梗塞、上消化道出血和妇科血症等方面取得了显著疗效。,5,前言,本实验采用RP-HPLC色谱法，结合对照品龙血素B建立人工诱导龙血竭与其基源植物的HPLC指纹图谱分析方法,阐明两者之间的差异，为人工诱导龙血竭是否能替代其基源植物提供基础数据,6,试验研究,1.材料与方法2.结果与讨论,7,材料与方法,2.1 化学试剂材料 氯仿（上海化学试剂有限公司生产） 乙酸乙酯（上海化学试剂有限公司生产） 甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯),磷酸(分析纯)，石油醚（分析纯）龙血素B对照品(中国生物制品检定所提供)2.2 植物样品样品为自然生长型龙血竭(龙舌兰科剑叶龙血树) 和人工诱导型龙血竭（云南大学微生物研究所提供）2.3 主要设备及仪器电子天平（型号BS124S Sartorius; d=0.0001g）高效液相色谱仪 旋转蒸发仪索式提取器 容量瓶（10ml）、量筒等。,8,材料与方法,3.1鉴别(1)取本品粉末5g，加氯仿25ml，置水浴中加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至适量。加硅胶2g，拌匀，蒸干，研匀。加于硅胶柱上(玻璃柱，内径10mm，硅胶3g，100200目，干法装柱)，用石油醚(6090)-氯仿(5:1)的混合溶液30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取剑叶龙血素C，加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录 B)试验，吸取上供试品溶液20l，对照品溶液10l，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶HF254薄层板上。以石油醚(6090)-氯仿(20:1)为展开剂,展开，取出，晾干。置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置下，显相同颜色的斑点,9,材料与方法,(2)取本品粉末0.5g，置索氏提取器中，加石油醚(6090)70ml，水浴中加热回流1小时。提取液置水浴上蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取龙血竭对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录 B)试验，吸取上述两种溶液24l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以氯仿-甲醇(99:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(110)，在105加热510分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(3)取鉴别(2)项下石油醚提取后的不溶物,挥尽石油醚，置索氏提取器中，加醋酸乙酯70 ml，水浴回流1小时。提取液浓缩至约5 ml，加聚酰胺2g，拌匀，蒸干，置于已处理好的聚酰胺柱上(玻璃柱，内径10 mm，1430目，5g，湿法装柱)，以50%乙醇100 ml洗脱(流速1.5 ml/min)，洗脱液弃去，继以乙醇50 ml洗脱(流速1.5 ml/min)，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加氯仿10 ml使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取龙血竭对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录 B)试验，吸取上述两种溶液各46l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚(6090)-醋酸乙酯(10:1)为展开剂，展开,取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液。在105加热约5分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点,10,结果,3.2.1对照品溶液的制备精密称取龙血素B对照品适量，加甲醇溶解，使成每1ml中含龙血素B 0.024mg溶液，作为对照品溶液。进样量10 l,见图1图1龙血素B色谱图3.2.2供试品溶液的制备称取人工诱导龙血竭与自然生长型龙血竭1 g，精密称定，加硅藻土2g，混匀，置索氏提取器中，加氯仿100ml，置水浴中加热回流6小时，提取液减压浓缩至近干，加醋酸乙酯适量使溶解。移置10 ml量瓶中，用醋酸乙酯洗涤容器并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。.2.3方法学考察精密度实验取龙血竭同一供试品溶液，连续进样6次，考察各色谱峰相似度的一致性，测得其各色谱峰相对峰面积的RSD3%，相对保留时间的RSD1%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。,11,重复性实验取龙血竭供试品溶液，连续进样6次，考察各色谱峰相似度的一致性，计算各共有峰相对峰面积的RSD3%，相对保留时间1%(n=6)。结果表明实验重复性良好。稳定性实验取龙血竭同一供试品溶液，分别在0、2、6、12、18、24、36、48 h检测，考察各色谱峰相似度的一致性，计算各共有峰相对峰面积的RSD3%，相对保留时间RSD1%(n=6)，结果表明供试品在48 h内稳定。龙血竭与人工诱导龙血竭指纹图谱的建立与比较按3.2.2分别分别制备6种龙血竭与6种人工诱导龙血竭供试品溶液，分别进样10 l，同一实验条件下测定龙血竭与人工诱导龙血竭供试品HPLC色谱图，结果分别见图2和3。两种供试品共有峰相对保留时间、相对峰面积范围见表1和表2,12,表1龙血竭共有峰相对峰面积峰号相对保留时间龙血竭样品表2人工诱导龙血竭共有峰相对峰面积,13,4 、讨论,本实验采用HPLC色谱法，结合对照品龙血素B对人工诱导龙血竭和其基源植物HPLC指纹图谱分析结果表明，人工诱导龙血竭和其基源植物均具有相对保留时间14.2和19.9的两个共有峰，且峰形相似度较高。虽然均未检测到龙血素B，但据此可以推测人工诱导龙血竭和其基源植物化学成分较为接近，但仍须结合药理学实验对其差异进行进一步研究。龙血竭