医学分子生物学思考题

1什么是基因工程它包括哪几个主要步骤基因工程（GENEENGINEERING）将不同生物体的核酸分子在体外经过酶切、连接，构建成重组的核酸分子，再把它导入受体细胞内，使外源基因在受体细胞中表达。基因工程研究应包括以下6个主要内容或步骤1）获取基因从复杂的生物有机体基因中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，分离出带有目的基因的DNA片段。2）克隆载体构建在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制，并带有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子克隆载体。3）克隆载体转化将克隆载体转入受体细胞，并与之一起增殖。4）克隆载体筛选从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了克隆载体的受体细胞克隆。5）克隆载体鉴定从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已经得到扩增的目的基因，并做酶切、序列分析等鉴定。6）表达载体构建和表达将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。把以上6个步骤称作是基因工程上游研究。2什么是限制性核酸内切酶举例说明。限制性核酸内切酶（RESTRICTIONENDONUCLEASE）简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA的酶。BAMH、ECOR、HIND、NOT、PST、SMA3什么是质粒理想的质粒载体应具备什么条件质粒（PLASMID）染色体外，能独立复制，能稳定遗传的一种环状双链DNA分子。理想质粒载体所必需具备的条件1质粒较小（35KB小质粒通常拷贝数较多，外源DNA容量较大,容易转化，容易分离，不易断裂，容易鉴定2带选择标记,对抗菌素的抗性，AMP,TET,KANA,NEO,互补3有单一限制性酶切位点多克隆位点MCS）单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入。多个不同的单一限制性酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。4具有复制起始点（ORI质粒DNA增殖所必不可少的结构。5作为原核表达载体还要有启动子，核糖体结合位点（SD）和终止子序列。6真核表达载体还要有真核表达调控元件包括启动子、增强子、转录终止序列、POLYA加尾信号等真核细胞复制起始序列真核细胞药物抗性基因4组织工程的三个重要组成部分以及它们的作用是什么细胞、生物材料和环境；细胞用以修复组织器官；生物材料为细胞提供支架供其生长；环境的作用是为细胞的生长提供必须的物质和必备的条件。三者作为一个整体构建组织、器官或其生物性替代物,以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。5种子细胞类型及其各自的优缺点种子细胞（STEMCELL）分组织来源的细胞和胚胎干细胞，组织来源的细胞优点构建出的组织在形态、结构和功能上与正常组织比较接近，缺点体外培养易老化、不易扩增，会造成供区部位的组织缺损和功能障碍；胚胎干细胞优点全能性，缺点安全性、伦理性。6举例说明组织工程技术可用于那些组织修复（要求简述构建过程）从理论上说可以用于修复所有组织，但从技术方面考虑，有些组织的培养还存在问题，现在主要用于修复皮肤、肌腱等组织。首先，取活体肌腱组织，制备成肌腱细胞培养皿，加入生长因子促进其分裂增殖，在培养时需烤炉低氧因素将，并且在切割后的硅胶培养皿中高密度培养,获得半成品后可以在体内外继续生长，注意周期性拉力因素，最后以手术方式将成品移植到机体身上，并继续观察。7试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。外源基因具备的条件编码区不含插入序列；（MRNACDNA）位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；含起始密码子、终止密码子；转录出的MRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）；产物比较稳定（如融合蛋白、信号肽）；选择系统偏好的简并密码。影响外源基因表达的因素启动子的强弱（主要因素）基因的剂量，RNA转译效率（SD互补、AUGSD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性）密码子、表达产物的大小、产物的稳定性。8蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。利用溶解度差别的分离方法、利用分子大小不同的分离纯化方法、根据蛋白质分子带电性质不同的分离方法、根据蛋白质吸附性质不同的分离方法、；利用蛋白质的特异性配体分离方法亲和层析，利用一些生物大分子可以和相应的物质特异而可逆的结合，如抗原和抗体、激素和受体、酶和抑制剂、酶和底物等，应用是将要分离的物质的特意的加上抗原片段，再让待分离液通过带抗体的硅胶层析柱，然后将吸附的物质洗下，再讲结合的抗原片段切除，即可得到较为纯的产物。9以人GMCSF为例，写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。技术路线表达载体的构建、外源基因片段的分离表达性重组体的构建转化宿主菌诱导表达表达产物的鉴定表达产物的分离对粒细胞作用的体内外实验。引物设计表达载体1GMCSF全基因PCR扩增提取正常人外周血粒细胞总RNA，GMCSF全基因的获得，以该总RNA为模板，用宝生物公司的BEABEST反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物P1，P2进行第一次PCR。GMCSF基因的获得以GMCSF全基因经纯化的PCR产物为模板，加入引物P1，P2，再次PCRGMCSF基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。2含肠激酶位点的PTHIOHISASTRAIL纯化后的GMCSFPCR产物用BAMHI、ECORI双酶切。质粒PTHIOHISA用同样的酶双酶切，胶回收酶切片段，T4DNA连接酶分别连接经双酶切的片段GMCSF和质粒载体，转化宿主菌BL21，筛选阳性克隆。小提质粒，酶切鉴定重组子，并对重组子进行测序分析。3诱导表达GMCSF在大肠杆菌BL21中的诱导表达。30MMOL/LIPTG诱导68H，表达达到高峰，经薄层扫描目的蛋白约占菌体总蛋白的39左右。表达产物部分可溶，其余形成包涵体。融合表达产物SDSPAGE表观分子量为32000DALTON左右（实际分子量为3560821DALTON）。4GMCSF融合蛋白的制备工程菌的培养挑取阳性克隆，接种于200ML含100G/ML氨苄青霉素的LB培养基中，37培养过夜。然后以1020的接种量扩大培养，IPTG诱导。超声破碎菌体离心收获的菌体按02G/ML重悬于A液20MMOL/LTRISHCLPH80，02MOL/LNACL，5MMOL/L咪唑，浴中超声破碎。12,000RPM/MIN离心15MIN，分别取上清和沉淀进行SDSPAGE分析目的蛋白以可溶性还是以包涵体形式存在。5STRAIL融合蛋白的纯化融合表达载体PTHIOHISA在硫氧还蛋白融和段带有组氨酸标签，用NI2固相化的CHELATINGSEPHAROSEFASTFLOW填料进行亲和层析。将可溶性表达产物（超声破碎菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2倍柱床体积以上的A液过柱，至基线平稳；用B液A液中加入咪唑至终浓度为50MMOL/L梯度洗脱510个柱体积，用AKATAEXPLORE进行检测，收集各洗脱峰。6GMCSF融合蛋白的肠激酶切割及纯化GMCSF融合蛋白的肠激酶切割按STRAIL融合蛋白肠激酶不同体积的比例酶切，SDSPAGE分析。GMCSF非融合蛋白的纯化以A液（25MMPH70的磷酸缓冲液）平衡SPSEPHAROSEFASTFLOW离子交换柱，将酶切后的反应液直接上柱，以B液（25MMPH70的磷酸缓冲液06MNACL）梯度洗脱，收集洗脱峰，以分离除去融合头。其中的目的峰再用分子筛SEPHARYLS200做进一步纯化及脱盐处理。用BRADFORD法测定蛋白质浓度，SDSPAGE分析检测。7GMCSF融合蛋白及非融合蛋白的WESTERNBLOT检测第一抗体兔抗人TRAIL多克隆抗体，11000稀释；第二抗体HRP标记的羊抗兔IGG抗体，1100001促进粒细胞生长实验2促粒细胞分裂实验10什么是信号转导其基本途径如何细胞特异识别外来信号分子，并转化为细胞可识别的信号，经系列级联反应，最终引起特异生物学效应的过程，称为信号转导SIGNALTRANSDUCTION，分离子通道受体、酶偶联受体、G蛋白偶联受体通道信号传导，G蛋白偶联受体通道信号传导又分CAMP信号通路、CGMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路。11请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。两个同理，举胰高血糖素的例子胰高血糖素与受体结合受体蛋白分子发生构象上变化受体与G蛋白S亚基结合亚基与GDP亲和力下降，与GTP亲和力增加，GTP置换GDP亚基变构，与、分离，同时与受体分离（G蛋白至功能状态）活化的G蛋白与AC结合，激活之AC催化ATP分解形成CAMP（第二信使）CAMP活化CAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）使靶蛋白磷酸化肝细胞糖原分解、糖异生、减少对葡萄糖的利用。12什么是表观遗传学（EPIGENETICS）它主要研究什么内容基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。（不依赖于DNA序列的遗传现象）；研究内容主要集中在三大方面DNA甲基化修饰基因选择性转录表达的调控，非编码RNA的调控作用基因转录后的调控，组蛋白修饰蛋白质的翻译后修饰。13什么是甲基化,在调控基因表达过程中起什么作用DNA甲基化DNAMETHYLATION是指在甲基化酶的作用下，将一个甲基添加在DNA分子的碱基上；DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态，DNA甲基化抑制基因表达。14什么是基因印记它的主要特征是什么父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，这种现象称为基因组印记（GENOMICIMPRINTING），由于源自某一亲本的等位基因或它所在染色体发生表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因子代细胞中表达不同。在基因组中的这类现象就是基因组印记；1每一个印记基因簇由一个印记控制元件（IMPRINTCONTROLELEMENT,ICE）所调控，2也称为印记控制区域（IMPRINTCONTROLREGION,ICR）或者印记中心（IMPRINTINGCENTRE,IC）,3绝大多数都有CPGISLANDS,能够发生DNA甲基化，4在CPGISLANDS内或附近通常有成簇的、有向的重复片段。15基本概念SIRNADICERPROTEINRISCPTGSSIRNA在RNAI的起始阶段，加入的DSRNA或内源性PREMIRNA被DICER酶切割为1923NT长的小分子干扰DSRNA（SMALLINTERFERINGRNAS,SIRNAS），称为引导RNAS；MIRNA；大小约2123个碱基的SSRNA，由具有发夹结构的约7090个碱基的SSRNA前体PREMIRNAPRECURSORS经DICER酶加工生成。非编码RNA，参与调控基因表达，但其机制区别于SIRNA介导的MRNA降解。具有高度的保守性，时序性和组织特异性；DICERPROTEINRNASEIII家族成员之一，可特异识别DSRNA，依赖ATP逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的DSRNA或PRIMIRNA,将RNA降解为3端有2个碱基突出的1923BP的DSRNASSIRNAS；RISC一种RNA蛋白质复合物，通过与目标MRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SIRNA组装SIRISC，MIRNA组装MIRISC。RISCS包括两种类型切割型和不切割型,这由RISC当中的AGO蛋白决定；PTGS转录后基因沉默POSTTRANSCRIPTIONALGENESILENCING，在基因转录后的水平上通过对靶RNA进行特异性降解而使其失活。16请说明RNAI的作用机制1RNAI的起始阶段引导RNAS，加入的DSRNA或内源性PREMIRNA被DICER酶切割为干扰DSRNA，由具有发夹结构的SSRNA前体PREMIRNAPRECURSORS经DICER酶加工生成MIRNA，2RNAI效应阶段RISC形成并识别降解MRNA。17请分析解释SUGUO的实验结果SUGUO的实验证明了导入一个目的基因的正义与反义RNA可以达到敲除某个基因的效果。因为该基因的野生型与突变型在胚芽时有对称与不对称的差异，所以她想从RNA共抑制现象（以前的研究结果）的基础上实现产生变异的效果，但是由于当时还没有研究清楚到底是哪种RNA起到了抑制的作用，所以她同时导入了正义与反义RNA，她当时的分析是反义的RNA可以特异性的与MRNA结合，从而阻止RNA的翻译以及以后的步骤，当然最后她成功了，用现在的科学成果进行分析和解释，由于她导入了正义与反义RNA，使得正义与反义RNA在细胞内特异性的互补形成了DSRNA，然后在被DICER酶切割为干扰DSRNA，然后随着RISC形成并识别降解MRNA。18什么是基因表达（GENEEXPRESSION）试述基因表达的特点及其调控对生物体的重要性。从DNA到蛋白质的过程；组织特异性（TISSUESPECIFICITY）、阶段特异性（STAGESPECIFICITY）、与环境相适应，（一）适应环境、维持生长和增值，（二）维持个体发育和分化。19真核生物中，基因的表达受不同水平的调控，请列举其中三种。转录前调控，转录调控，转录后调控，翻译调控，翻译后调控。20为什么说转录起始的调控是基因表达调控的中心环节因为在最开始就决定该基因是否表达，而不是等表达产物已经合成后再决定是否需要的话，可以从源头上节约原料，从而提高表达的效率。21举例说明DNA甲基化与肿瘤的关系。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达，甲基化模式的混乱与异常发育和癌症有关，肿瘤的甲基化状态改变包括基因整体甲基化水平降低、正常非甲基化CPG岛的高甲基化和维持甲基化模式的酶的调节失控，从而导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。22简述构建基因打靶载体所需的基本DNA元件及其功能。基因上下游有同源序列，用于配对要剔除的基因使用；基因上下游还需要LOXP片段，通过CRE酶水解并连接得到剔除基因的DNA序列；NEOMYCINR（新霉素A,新霉胺氨基苷类抗生素）基因位于要替换基因的相对位置，提供阳性对照，用于筛选替换成功的细胞；HSVTK（单纯疱疹病毒胸苷激酶）位于下游同源基因的下游，提供阴性对照，用于排除由于非同源重组产生的替换成功的细胞。23为何在筛选靶基因敲除的胚胎干细胞时还需经历阴性筛选过程简述更昔洛韦（GANCICLOVIR）在胚胎干细胞阴性筛选中的作用机制。因为在重组的过程中还会产生非同源重组替换成功的细胞，而此细胞不是研究所需要的，故需要筛选后去除；外源添加更昔洛韦后（丙氧鸟苷），由于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的产物病毒胸苷激酶能将丙氧鸟苷磷酸化为三价磷酸盐从而抑制细胞内DNA合成，从而导致细胞的死亡，而同源重组替换成功的细胞因为没有病毒胸苷激酶所以没有抑制DNA合成的功能，使得细胞存活，这样就能保证筛选的准确性。24什么是细胞凋亡APOPTOSIS细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。25细胞凋亡有哪两条主要的途径一、由死亡受体FAS、TNFR）介导的外源途径。在这条途径中，启始CASPASE8首先被激活；二、线粒体介导的内源途径。在这条途径中，启始CASPASE9首先被激活；细胞凋亡后期的共同途径效应CASPASE3的激活。26BCL2家族的分类和结构特征B细胞淋巴瘤/白血病2基因BCELLLYMPHOMA/LEUKEMIA2GENE,BCL2，BCL2家族成员分为两类一、抗细胞凋亡，如BCL2、BCLXL、AL、BCLW、MCL1。在这类分子中，都有BCL2同源区14BCL2HOMOLOGYDOMAINS，BH1BH4的结构。二、促进细胞凋亡。在这类分子中，又分为两个亚族BAX亚族，如BAX、BAK、BOK，有BH1、BH2和BH3的结构；BH3ONLY亚族，如BIK、BAD、BID、BIM，只有BH3的结构。27P53基因在细胞DNA损伤中的作用。P53的两大功能使细胞在G1期停滞。当DNA损伤后，P53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA不能被修复，P53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。28转录组及蛋白组的概念分别是什么其研究内容分别包括哪些方面转录组（TRANSCRIPTOME）指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的可直接参与蛋白质翻译的MRNA（编码RNA）总和，而其他所有非编码RNA均可归为RNA组（RNOME），转录组学（TRANSCRIPTOMICS）是在整体水平上研究细胞编码基因转录情况及转录调控规律的科学；蛋白质组（PROTEOME）意思是PROTEINSEXPRESSEDBYAGENOME（基因组表达的所有蛋白质），细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质即蛋白质组（PROTEOME），蛋白质组学（PROTEOMICS）以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，故又称为全景式蛋白质表达谱（GLOBALPROTEINEXPRESSIONPROFILE）分析。29如理利用转录组学及蛋白组学的方法筛选疾病相关基因（写出主要的检测指标及其实验方法的名称）转录组的研究方法（一）微阵列杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，（二）SAGE将9个碱基的标签集中于一个克隆中进行测序（三）MPSS标签序列与长的连续分子连接在一起，便于克隆和序列分析。蛋白质组学二维凝胶电泳以2DE分离为核心的研究路线混合蛋白首先通过2DE分离，然后进行胶内酶解，再用质谱进行鉴定。以色谱分离为核心的技术路线混合蛋白先进行酶解，经色谱或多维色谱分离后，对肽段进行串联质谱分析以实现蛋白的鉴定。双向凝胶电泳利用蛋白质的等电点和分子量,蛋白质的胶内酶切质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。30简述蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）PR内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠，所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力，金属PR中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属PR，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。最优的AA侧链几何排列。PR侧链构象由空间两个立体因素所决定一是立体势垒，二是AA的位置结构及功能的专一性。这是PR设计最困难的问题。31简述蛋白质分子设计的原则1活性设计，2对专一性的设计，3SCAFFOLD设计框架，4疏水基团与亲水基团需合理分布，5最优的氨基酸侧链几何排列。32结合你的专业，论述线粒体与医学的关系。线粒体是营养物质最终彻底氧化分解的场所,线粒体还是合成嘧啶、血红素、铁硫簇等的场所,线粒体与细胞代谢、免疫、老化、凋亡、自噬等的信号途径密切相关。线粒体异常与遗传异质的众多疾病相关联，累及各种器官系统，各个年龄段，几乎覆盖整个医学领域。线粒体与自由基损伤、细胞死亡、衰老、代谢病、神经肌肉退行、心血管病、创伤、肿瘤、肥胖、糖尿病等的关系已成为研究热点。线粒体失调与氧化损伤、代谢病和老年病密切相关，天然线粒体营养素和药物可有效发挥预防和治疗作用。线粒体保留的少量细菌和病毒祖先成分对抗生素敏感（如线粒体翻译对氨基糖甙类和四环素敏感）。线粒体与运动、营养和药物的更多关系还有待深入研究。分子水平出现问题也能导致疾病，线粒体与衰老有关。33线粒体遗传有哪些特点线粒体拥有独特的基因组及复制、转录和翻译系统。线粒体DNA是遗传系统极度简化的杰作。仅165KB的人MTDNA仅编码2种RRNA、22种TRNA和13种肽。线粒体遗传特点半自主性、高突变率、遗传密码特殊、母系遗传、遗传瓶颈、阈值效应、累加效应。线粒体拥有特有的DNA聚合酶、RNA聚合酶和核糖体。使用简化版遗传密码表，因类群而异，通常没有1度和3度简并密码子，有4个终止密码子。线粒体DNA是严格母系遗传。精子线粒体不能进入卵子，即使偶尔进入，也会被降解。因此，动物体的MTDNA只来源于卵细胞。34阐述单克隆抗体制备的基本原理，鼠源抗体在临床应用上存在哪些问题，如何用基因工程的方法对鼠源抗体进行改造单克隆抗体是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的，其重链和轻链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。不能有效激活人体中补体和FC受体相关的效应系统；被人体免疫系统所识别，产生HAMA（人抗鼠抗体反应）效应；在人体循环系统中很快被清除。人鼠嵌合抗体用人IGG的恒定区取代小鼠IGG的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。人源化抗体利用现有的大量已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲