分子生物学实验设计-蚕豆病-G6PD-临床诊断-医学生-生化代谢-实验室检查结果-遗传病-本科生.ppt

,班级：组员：主讲：,分子生物学设计实验,案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。,临床表现：1体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促2皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。3心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。,实验室检查：,胆红素形成尿胆素原,1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？,初步诊断：蚕豆病，伴溶血性黄疸,发病原因：遗传因素；由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。,2.请设计实验进一步明确诊断。要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。,紫外法测G6PD活性【实验原理】G6PD活性的表示方法常用U/L、U/gHb两种形式。其中U/gHb定义为：每克Hb在25的环境中每分钟产生1umolNADPH为一单位（U）。G6PD催化G6P脱氢生成NADPH。NADPH在340nm处有最大吸收峰，Hb被氧化成高铁Hb后在540nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出NADPH及Hb的含量，从而推算出G6PD的比活性。,【实验器材】恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心机,【主要试剂】0.5mol/LTris-HClMgCl2缓冲溶液（pH8.0）、2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、6mmol/L葡萄糖-6-磷酸二钠（G6P-Na2）、溶血剂、血红蛋白氧化试剂、0.9NaCl，ACD抗凝剂。,【结果与分析】1、NADPH产量的计算:NADPH产量（mol）=A3406.222、血红蛋白含量的计算:Hb含量（mmol）=A540/443、G6PD比活性（U/gHb）的计算:G6PD比活性单位（U/gHb）=(A340A540)49.85,【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb。,【实验步骤】,1、洗涤红细胞2、溶血液的制备3、NADPH的测定4、溶血液中血红蛋白含量的测定,【注意事项】1、洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。2、测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。,【备注】样本采集须知1、病人准备：空腹2、采样时间：清晨3、样本容器：一次性采血管4、抗凝剂：首选肝素，其次EDTA-K2、枸橼酸钠。5、采样的方法和步骤：按常规静脉采血法，采样后立即充分混匀，避免产生气泡，气泡会导致溶血。,【实验名称】葡萄糖6磷酸脱氢酶的荧光斑点试验,【实验方法】基于NADPH可发出荧光，6-磷酸葡萄糖和NADP加入到测试细胞的溶血产物中，经短暂孵育后，混合物在滤纸上出现斑点，在长波紫光下检测，荧光表明NADP的存在。,【实验原理】6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸,G6PD,NADPNADPH,还原,长波紫外光365nm的激发,荧光,【G6PD缺陷筛查】,【试剂和仪器】,6-磷酸葡萄糖钠盐、辅酶钠盐、三羟基氨甲烷（Tris）、浓盐酸、皂素溶液、氧化型谷胱甘肽、蒸馏水,混合试剂的成分与配方：0.01mol/L6-磷酸葡萄糖钠盐取6-磷酸葡萄糖钠盐3.05mg溶于1ml蒸馏水中7.5mmol/L辅酶溶液（NADP）取辅酶钠盐6.379mg，加蒸馏水至1ml0.75mol/LpH7.8Tris-HCL缓冲液取三羟基氨甲烷（Tris）4.5428g,加浓盐酸2ml调整pH为7.3,加蒸馏水至50ml备用.用时取3ml10g/L皂素溶液2ml8mmol/L氧化型谷胱甘肽液氧化型谷胱甘肽2.45mg,加蒸馏水到1ml蒸馏水2ml将以上6种液体混合,分装后置-20保存,【实验操作流程】,2.标本采集:肝素化毛细血管从手指采集外围血液3.取小试管3支，标明患者、正常对照和阳性对照。往各管加入混合试剂0.2ml在反应0分钟（混匀后立即吸出）、5分钟、10分钟后，分别从各吸管吸出反应液1滴，加在滤纸上，使充分干燥在暗室内，用波长340370nm的紫外线照射滤纸上的斑点，检查有无荧光正常人0分钟斑点无荧光，5分钟和10分钟斑点出现荧光，而10分钟斑点荧光最强。G6PD缺乏的患者在0、5、10分钟均无荧光,【结果分析】正常人：510分钟出现很强荧光G6PD部分缺陷者：510分钟出现很弱荧光G6PD缺陷者：510分钟甚至10分钟以后均无荧光,【注意事项】每次都要有G6PD正常和缺陷标本作为对照本法是直接测定NADPH的活性量，特异性较好。但不能确认杂合子状态。,3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。,缺乏G6PDNADH红细胞大量破坏胆红素未结合胆红素不可经肾尿排出未结合胆红素,单核吞噬细胞系统,产生,红细胞大量破坏,血管内溶血,蛋白尿,潜血,尿液镜未见红细胞,皮肤及巩膜染黄,易通透细胞膜,4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？,检测技术：荧光法；紫外法检测基因：G6PD基因（位于人类基因组的