刘志强分子生物学技术作业酵母双杂交技术

分子生物学技术原理论文题目酵母双杂交技术课程分子生物学技术原理姓名刘志强学号XXXXXXXXXXXXX2012年12月20号酵母双杂交技术摘要随着多种生物大规模基因组测序的完成，生命科学领域又迎来了一个重要的时代功能基因组学和蛋白质组学时代。酵母双杂交技术是在酵母细胞内研究蛋白质与蛋白质相互作用的非常有效的分子生物学技术，已被广泛的运用到蛋白质组学和功能基因组学研究中。随着分子技术的发展，该技术也在蛋白质与RNA、DNA和配体之间相互作用的研究中取得了许多有价值的发现。本文就酵母双杂交技术的原理、运用、发展及所存在的问题进行了综述。关键词酵母双杂交；功能基因组学；蛋白质组学ABSTRACTTHESCIENCEOFLIFESTEPSINTOANEWERAALONGWITHTHECOMPLETIONOFMANYKINDSORGANISMSSGENEHAVEBEENSEQUENCEDTHEYEASTTWOHYBRIDTECHNOLOGYISANEFFECTIVEMETHODUSEDTORESEARCHTHERELATIONSBETWEENPROTEINSINYEASTCELLSHAVEBEENWIDELYUSEDINTHERESEARCHOFPROTEOMANDFUNCTIONALGENOMICSWITHTHEDEVELOPMENTOFMOLECULARTECHNIQUES,THEYEASTTWOHYBRIDTECHNOLOGYALSOOBTAINEDMANYVALUABLEDISCOVERYINTHERESEARCHOFTHEINTERREACTIONESBETWEENPROTEINS,PROTEINANDRNA，PROTEINANDDNA,PROTEINANDLIGANDTHEPRINCIPLE,FUNCTION,DEVELOPMENTANDPROBLEMARESUMMARIZEDINTHISREPORTKEYWORDSTHEYEASTTWOHYBRIDTECHNOLOGYPROTEOMICS；FUNCTIONALGENOMICS酵母双杂交技术人类基因组计划（HGP）已在2002年完成，并且一些重要的模式生物的基因组测序工作也相继告终，这标志着生命科学领域另一个新时代的到来，而这个新时代注定是对基因功能破解的时代，而蛋白质组学PROTEOMICS和功能基因组学FUNCTIONALGENOMICS将会是该时代的主要组成部分。蛋白质组学和功能基因组学都离不开对蛋白质的研究。系统综合分析蛋白一蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息1。酵母双杂交是目前研究蛋白一蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法2。并且酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实3。酵母双杂交由FIELDS在1989年提出。它的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。而随着各项技术的不断完善，酵母双杂交技术也有了很大发展。1酵母双杂交技术的原理真核细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（MODULAR）,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域（DNABINDINGDOMAIN）和转录激活结构域（ACTIVATIONDOMAIN），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。单独的DNA结合结构域虽然能和启动子结合，但是不能激活转录，而不同转录激活因子的DNA结合结构域和转录激活结构域形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。以酵母细胞中的转录因子GAL4为列，转录因子GAL4中位于N端1147位氨基酸残基区段的DNA结合域够识别位于GAL4效应基因（GAL4RESPONSIVEGENE）的上游激活序列UPSTREAMACTIVATINGSEQUENCE，并与之结合。位于C端768881位氨基酸残基区段的转录激活域是通过与转录机构（TRANSCRIPTIONMACHINERY）中的其他成分之间的结合作用，以启动上游激活序列下游的基因进行转录4。DNA结合结构域和转录激活域单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。FIELDS建立了一个双杂交系统，DNA结合结构域与X蛋白融合，转录激活域与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录。他们利用SNF1与SNF4的相互作用，将SNF1与DNA结合结构域融合，SNF4与转录激活域融合，构建在穿梭质粒上。其中SNF1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是他的一个结合蛋白。研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY171菌株，该菌株含有LACZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由SNF1和SNF4相互作用使得DNA结合结构域和转录激活域在空间上接近，激活了报告基因LACZ的转录。一般地，将DNA结合结构域X的融合蛋白称作诱饵（BAIT,X往往是已知蛋白，转录激活域Y称作猎物（PREY），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。2酵母双杂交技术的运用酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。主要应用有发现新的蛋白质和蛋白质新的功能、在细胞内研究抗原和抗体的作用、筛选药物作用位点及药物对蛋白质相互作用的影响、建立基因组蛋白连锁图。3酵母双杂交技术存在的问题酵母双杂交技术作为分析蛋白质与蛋白质相互作用的分子生物学技术，具有高效、快速和灵敏等诸多优点。但是在应用的过程中仍发现其存在一定的局限性双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性“5。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性“结果。4酵母双杂交技术的发展WANGANDRODD6基于酵母双杂交系统提出的酵母单杂交系统用于研究DNA与蛋白质之间的相互作用。酵母单杂交系统灵敏度高，可直接获得与DNA结合的蛋白质基因序列。但是，与双杂交相似，酵母单杂交技术同样也会出现“假阳性”问题，有待进一步完善7。在许多细胞信号转到过程中，两种蛋白质之间的相互作用会涉及到第三种分子，该分子可以是蛋白质、核酸或小分子多肽。而由SENGUPTA8发展起来的酵母三杂交系统可以有效提高这方面的研究工作。另一种由酵母双杂交系统发展得到的技术为逆向双杂交系统9。逆向双杂交系统是由SHIH等创立的，可作为酵母双杂交系统较好的补充。逆向双杂交系统的特点在于构建建一种反向筛选报告基因即蛋白间特异相互作用所激活的报告基因能阻碍转化体的生长，从而发现蛋白间结合的解离因素。5小结在后基因组时代，酵母双杂交技术以其特有的优点在分子生物学研究中具有非常重要的作用。虽然存在一定的问题，但随着问题的解决和技术的不断完善，酵母双杂交技术及由此技术而衍生的新技术将继续在蛋白功能的研究乃至其它生命科学领域发挥更重要的作用。参考文献1SOELLICKTRUHRIGJFDEVELOPMENTOFANOPTIMIZEDINTERACTIONMATINGPROTOCOLFORLARGESCALEYEASTTWOHYBRIDANALYSESJGENOMEBIOL,2001,21252602FIELDSS,SONGOANOVELGENETICSYSTEMTODETECTPROTEINPROTEININTERACTIONSJNATURE198934062302452463李先昆，聂智毅，增日中酵母双杂交技术研究与应用进展JOURNALOFANHUIAGRISCI2009,37728672869,29264FIELDSS,STERNGLANZRTHETWOHYBRIDSYSTEMANASSAYPROTEINPROTEININTERACTIONSJTRENDSGENET1994,1082862925WITTMANNS,CHATELH,FORTINMGINTERACTIONOFTHEVITALPROTEINGENOMELINKEDOFTURNIPMOSAICPOTYVIRUSWITHTHETRANSLATIONALEUKARYOTICINITIATIONFACTORISO4EOFARABIDOPSISTHALIANAUSINGTHEYEASTTWOHYBRIDSYSTEMJVIROLOGY,1997,23484926WANGMM,REEDRRMOLECULARCLONEOFTHEOLFACTORYNEUNONALTRANSCRIPTIONFACTOROLF1BYGENETICSELECTIONINYEARSJNATURE,1993，3641211267ABRTELPL,FIELDSSTHETWOHYBRIDSYSTEMMNEWYORKOXOFORDUNIVERSITYPRESS,19972892978BACHARACHE,GOFFSPBINDINGOFHUMANIMMUNOD