全自动临床样品核酸的纯化和应用(精).ppt

全自动临床样品核酸的纯化和应用,生产工具推动社会进步，进步的源泉来源于不断创新。QIAGEN-BioRobot,QIAGEN公司简介,来自德国，创建于1985年，世界上最优秀的核酸纯化厂商。年销售额数十亿美金，产品畅销全球。提供各种样品核酸纯化的优质试剂。根据单个样品量不同，有不同的纯化试剂盒；根据样品数量不同，有各种通量的试剂盒。提供全自动核酸纯化工作站，此工作站同时具备自动移液功能，并可以和其他仪器联合使用，具有不同的扩展功能。,QIAGEN公司仪器简介,BioRobot9600：通量较低的标准型BioRobot9604：用于临床样品标准型BioRobot3000：多功能用户定制型BioRobot8000：高通量全自动标准型BioRobotRapidPlate：96和384孔板移液系统BioRobotTwisterI：存储和移板系统，和3000连用，也可和酶标仪、PCR仪等连用。BioRobotTwisterII：和8000连用，功能同I型。,BioRobot9604主要功能,专为临床样品的核酸自动纯化设计，可以得到高纯度的基因组DNA、病毒DNA及RNA。样品来源：各种血样、体液、口腔刮离细胞及细胞培养物等。所得到的核酸用于分子诊断、病毒检测，血液分型、法医DNA指纹鉴定、制药公司药物筛选等。,BioRobot9604主要优点,分子诊断所需DNA/RNA的自动纯化精确、快速的液面定位系统和移液系统满意的得率和可信的结果自动的样品跟踪和过程控制系统同时进行96样品，且有很好的可重复性一次性带滤芯枪头可安全处理有传染性的样品配套的高质量试剂简单易学的软件操作系统,BioRobot9604亚型,A：ViralRNAB：ViralRNA/DNA，GenomicDNA，Swab，AmplificationSetup。C：TotalRNA，CytoplamicRNA。,BioRobot9604硬件介绍,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,X-Y-Z-RoboticArm：液面定位和自动移液DilutorSyringeDrives：对移液量的精确检测VacuumManifoldSystem：产生负压，从纯化板抽滤掉各种缓冲液SampleidentificationSystem：样品条形码读取系统Tip-DisposalStation：去除一次性带滤芯枪头,1,2,3,4,5,Tip-RackHolderArea：可存放足够的一次性带滤芯枪头ExternalReagentDeliveryModule：各种缓冲液存放位置High-SpeedPipettingSystem：控制4个加液头的加液速度LabwareIdentificationSystem：手持型96孔纯化板条形码读码系统QIAsoftOperationSystem：简单好学的操作系统，编好的操作程序，亦可根据需要自己编写程序,6,7,8,9,10,SafetyShield：安全防护罩MultipurposeSlot：多功能槽，可以放收集管等ThermoblockSlot：加热模块，用于升高温度以加快蛋白裂解等,11,12,13,QIAsoftOperationSystem,在WINDOWS95基础上编写而成有编好的现成操作程序，看懂英文就会操作可以根据自己的需要自行编写程序,QIAsoft3.0运行环境,ExecuteEnvironment：运行已编写好的程序，并有配套的试剂盒提供。EditEnvironment：创建和编写自己的程序。SetupEnvironment：用于增加和调整slot和rack的位置，与EditEnvironment同时使用。,QIAsoft3.0MainMenu,EXCUTE:StartSampleProcessingEDIT:CreateYourOwnProtocolsSETUP:AdjustWorkTableConfiguration,ExecuteEnvironment,PROCESSPANEL,TIMEPANEL,MASSAGELOG,PROCOTOL,BioRobot9604样品来源,BioRobot9604配套试剂,试剂盒中含有用于结合核酸的硅胶膜板和收集板、封口膜等所有附件。试剂盒中有足够的各种缓冲液用于纯化所规定的样品数。每一个试剂盒都有对应的已经编好的程序。,核酸纯化原理,吸附,洗脱,高盐乙醇低PH,核酸（水相）,核酸（结合硅胶膜）,低盐高温高PH,NucleicAcidinSolution,EffectofChaotropicSalts,BindingofNucleicAcid,QIAamp8DNABLOODBioRobotKit(72)QIAamp96DNABLOODBioRobotKit(12),从新鲜或冻存的血液、血清、骨髓、体液、细胞悬液自动纯化基因组、线粒体和病毒的DNA。2个小时内从200UL样品中得到6UGDNA。用于一般的分子生物学操作外，还可以用于HLA分型、基因疾病的诊断等。,QIAamp96VirusBioRobotKit(12)QIAamp96VirusRNABioRobotKit(12),从血浆、血清、尿液、脑脊/髓液、无细胞的体液、细胞培养上清液中自动纯化病毒的RNA/DNA。前者可以在2.5个小时内从200UL样品中同时得到90%以上的DNA和RNA，后者可以在20-40分钟内从140UL样品中得到90%以上的病毒RNA。所得到的DNA/RNA主要用于病毒检测和分型。如肝炎病毒A-G，HIV，CMV和肠道病毒等。,QIAamp96DNASwabBioRobotKit(12),从棉签（如口拭子）上纯化DNA在2个小时内可得到1-2UGDNA所得到的DNA除可以用于一般的分子生物学操作外，还可以用于HLA分型、基因疾病的诊断、亲子鉴定等。,RNeasy96BioRobotKit(24),从人和动物细胞中纯化总RNA和细胞质RNA可以在75分钟内从10-5X106细胞中得到100UGRNA所得到的RNA除可以用于一般的分子生物学操作外，还可以用于高通量药物筛选、药物研究和分子诊断等。,自动纯化的过程和应用,因样品不同而大同小异，主要是样品的预处理和所用的缓冲液有所不同，这在各个产品的操作手册中都有详细说明。以从全血中纯化核酸为例作一些介绍,从200UL样品中得到6UGDNA，纯度可以达到90%以上，并在2个小时内处理完96个样品。,QIAamp96DNABLOODBioRobotKit(12),NumberofPreparations12x96QIAamp96plates12Square-WellBlocks14TapePad1x25sheetsAirPoreTape1x25sheetsCapsforCollectionMicrotubes8x120CollectionMicrotubeRacks122-mlTubesforQIAGENProtease50CapsforQIAGENProtease50,QIAamp96DNABLOODBioRobotKit(12),15-mlTubesforBufferAL15QIAGENProtease6x140mgProteaseSolvent(sodiumazide)6x10ml500-mlBottleforBufferAW21BufferAL(chaotropicsalt)1x330mlBufferAW1(concentrate)6x175mlBufferAW2(concentrate)4x274mlBufferAE48x5mlHandbook1,三种缓冲液的作用,QIAGENProtease：裂解蛋白。ProteaseSolvent(sodiumazide)：含叠氮化钠的蛋白溶解液，防止蛋白酶被菌污染。BufferAL(chaotropicsalt)：在乙醇存在条件下，形成高盐体系，同时蛋白酶在AL中能更好地裂解细胞，使DNA结合在硅胶膜上。BufferAW1(chaotropicsalt和ethanol)：去除硅胶膜上的抑制剂（如血红素、糖酸、肝素、铁离子等PCR抑制剂）。BufferAW1（ethanol）：将硅胶膜上的盐去掉（AL、AW1）,纯化过程,水和全血PCR产物的比较,PCR产物的分析,从水中得到的产物经过PCR后没有扩增出任何产物。从全血得到的产物经过PCR后扩增出产物，且条带一致，说明重复性很好。,重复性和纯度检验,RNA：A260/A280=1.9-2.1；DNA：A260/A280=1.7-1.9得率基本上在6ug左右，A260/280=1.8左右,HLATyping,SSP-PCRanalysisofdonorDNAusingprimersspecificforHLAgenesDRB(lanes123)andDQB(lanes2445).GenomicDNAwasisolatedfromhumanwholebloodusingtheQIAamp96DNABloodBioRobotprocedureandamplifiedwith45differentallele-specificprimerstargetedatgenesDRB1throughtoDRB5,andDQB1.Allele-specificampliconsappearasintensebandsbelowthe439bpcontrolamplicon(humangrowthhormonegene)inlanes8,9,22,37,38,and40.,HumanLeucocyteAntigenTyping,FactorVAnalysis,FactorVLeidengenotypingusingLightCycletechnology.ThefigureshowstwopeakscorrespondingtotheDNAmeltingtemperaturesrecordedforthewil