课题3　血红蛋白的提取和分离 (4)

课题3血红蛋白的提取和分离,一、基础知识：（一）蛋白质提取和分离原理（二）蛋白质提取和分离的方法1）凝胶色谱法：又称分配色谱法2）电泳法（三）缓冲液的作用,二、实验操作实验步骤,二、实验操作实验步骤,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力,1.凝胶色谱法,（1）原理：（2）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,概念：,3.原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,较大,较小,垂直向下的运动,无规则的扩散运动,较快,较慢,较短,先流出,较长,后流出,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,影响蛋白质分子运动速度的因素,由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,（4）缓冲溶液洗脱剂作用：配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。,思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。该化合物是由_和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,1.洗涤红细胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,烧杯,有机溶剂血红蛋白,4.透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？,注意：色谱柱不能内不能有气泡；装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝胶是凝胶装填紧密,装配好的凝胶柱,（3）样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,开始进行层析,3.样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样3.再调液面,4.洗脱,5.收集,收集得到的纯化后的蛋白,注意事项,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4.色