课题3　分解纤维素的微生物的分离

生物,生物技术实践,选修1,昆十中生物组,专题2微生物的培养与应用,课题3分解纤维素的微生物的分离,课题3分解纤维素的微生物的分离,一、课题背景,1.纤维素,一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，含量最丰富的多糖类物质。,课题3分解纤维素的微生物的分离,一、课题背景,1.纤维素,课题3分解纤维素的微生物的分离,一、课题背景,2.纤维素酶,一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,课题3分解纤维素的微生物的分离,一、课题背景,2.纤维素酶的实验,甲乙,取两支试管，编号甲、乙分别放入滤纸条分别加入等量缓冲液向甲试管加入纤维素酶向乙试管加入等量缓冲液将两支试管固定在锥形瓶中140r/min的摇床振荡1h,二、基础知识,1.纤维素分解菌的筛选,刚果红染色法,CR二苯基-4,4-二（偶氮-2-）-1-氨基萘-4-磺酸钠棕红色粉末溶于水呈黄红色可作酸碱指示剂(蓝紫3.5-5.2红),纤维素分解酶,课题3分解纤维素的微生物的分离,二、基础知识,1.纤维素分解菌的筛选,刚果红染色法原理,刚果红,纤维素,红色复合物,纤维素被分解纤维二糖和葡萄糖不与刚果红反应红色消失,出现透明圈,二、基础知识,刚果红染色法,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,分布环境,富含纤维素的环境中,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,1.土壤取样：,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,2.选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,1.该配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,2.这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。,三、实验设计,课题3分解纤维素的微生物的分离,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,3.你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,三、实验设计,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在以纤维素为主要碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,增加菌种浓度,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,3.梯度稀释,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基,（2）涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1mL涂布到平板培养基上，30倒置培养。,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,方法一：先，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、实验设计,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30-37培养，可获得纯化培养。,6.纯化培养,课题3分解纤维素的微生物的分离,四、课题延伸,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和_发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、小结,分