高中生物选1血红蛋白的提取和分离ppt课件

.,人教版选修1,专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离,.,一、基础知识：（一）蛋白质提取和分离原理（二）蛋白质提取和分离的方法1、凝胶色谱法：又称分配色谱法2、电泳法（三）缓冲溶液,.,二、实验操作实验步骤,.,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力,.,1.凝胶色谱法,1）原理：2）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,概念：,.,.,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷,.,影响蛋白质分子运动速度的因素,.,3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,.,由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂1）作用：2）配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定,从而维持蛋白质空间结构。,思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？,.,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的有机化合物是_。该化合物是由_和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,.,1.洗涤红细胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,其他血细胞,.,2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？,.,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,烧杯,有机溶剂血红蛋白,.,20mmol/L磷酸缓冲液,4、透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,.,纯化方法本实验采用凝胶色谱法,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,3.样品的加入和洗脱,.,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？,2、凝胶色谱柱的装填,.,3、样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样3.再调液面,4.洗脱,5.收集,注意事项,.,注意事项,1、红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2、色谱柱的装填：装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3、凝胶的预处理：沸水浴时间短，还能除去微生物和气泡4、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,否则容易使白细胞、血小板、淋巴细胞等其他血细胞同红细胞一块儿沉淀，而无法将红细胞分离！,.,纯度鉴