课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

,一、研究思路,(一)筛选菌种,1实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,启示：,寻找目的菌种时要根据它对_，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq细菌,能筛选到的原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。,在实验室中，如何才能筛选出我们想要的微生物？例如：分解尿素的微生物？,选择培养基：,在微生物学中，将允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物在无氧条件下：分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物,专题2微生物的培养与运用2.2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数,回答：1、在该配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的是什么物质？2、绝大多数的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，请分析该培养基是否对微生物有选择作用？如果有，是如何进行选择的？,葡萄糖、尿素,（二）统计菌落数目,常用方法：稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）（间接）显微镜直接计数法,原理1个菌落1个活菌,选择菌落数在30300的平板上计数。需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。请说出上述注意事项的原因,注意事项,稀释涂布平板法,计算公式：,某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,每克样品中的菌株数=（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数,（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。（2）方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。（3）操作：先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取稀释的样品液，滴于盖玻片边缘，让稀释的样品自行渗入。多余培养液用滤纸吸去。然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。（4）计算公式每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数（5）缺点：不能区分死菌与活菌。,显微镜直接计数法（直接）,看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,土壤取样,制备培养基,二、实验设计,（一）土壤取样,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,（二）制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,（三）样品稀释涂布平板,稀释倍数为101106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个蛋白胨培养基、1个空白培养基。,（三）样品稀释涂布平板,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，其目的是保证获得菌落在30300之间，适于平板的计数。,（四）微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,四、结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,三、操作提示,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三制定计划,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,土样不同培养基污染(或混入了其他的含氮物质),(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_,A无误,培养基的配,制有问题。,四、结果分析与评价,2.获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这一稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,五、课题延伸,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明