动物细胞工程医学PPT

动物细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,动物体细胞核移植技术和克隆动物,思考与回忆：1、动物细胞全能性特点？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,一：动物细胞培养 二：核移植技术,本节内容：,一、动物细胞培养的应用和概念：,1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,2、原理：细胞增殖,定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。,原代培养,3：过程,图示,原代培养,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）,传代培养,3、总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,剪碎用胰蛋白酶处理,10代细胞,转入培养瓶,40-50代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液稀释,传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）,为什么用胰蛋白酶处理？,分瓶传代培养,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。,细胞株：一般说遗传物质未改变,细胞系：遗传物质已改变,原代培养,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,4.动物细胞培养的条件:,1）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4,液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。,4）气体环境：,2）营养：,3）温度和pH：,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。,对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题8、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？,10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,5.动物细胞培养技术的应用:,1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物,植物组织培养和动物细胞培养的比较：见导学教程P31表,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,3、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2、原理： 动物细胞核具有全能性,4、体细胞核移植过程-示动物克隆-无性繁殖,1.）克隆羊多利培育过程：,另一头绵羊的子宫,特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕受体,1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示： b表示:,2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：,体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,3、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。,4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为,核移植,胚胎移植,白色,多利全部的核基因都来自白面绵羊,aa,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法：激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,核移植流程:,1、供体细胞的采集与培养,5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。,6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。,4、将供体细胞注入去核卵母细胞,3、显微操作去除卵母细胞中的核,2、受体卵母细胞的采集与体外培养,7、胚胎移植入代孕母牛体内,8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。,4.体细胞核移植技术的应用前景,5.体细胞核移植技术存在的问题,看书P49-50页,1.概念：,动物细胞融合（cell fusion）也称细胞杂交(cellhybridization),是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。,一、动物细胞融合,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）并能进行正常的有丝分裂,2.过程：,什么是病毒的灭活？（教材P52资料卡 ）,灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。,灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,3.原理：,细胞膜的流动性细胞增殖,4.诱导方式,物理法：,化学法：,生物法：,灭活的病毒,电激、振动、离心,聚乙二醇（PEG）,例如：仙台病毒,5.意义,突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能；重要用途：制备单克隆抗体。,细胞增殖,二、单克隆抗体,凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。,抗原：,抗体,当机体受到抗原刺激后产生，并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的蛋白质,人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？虽然动物体内存在百万种以上抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。可以通过克隆单一B淋巴细胞获得单一抗体能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？理论上行得通。实际上，B淋巴细胞在体外不能无限增殖。怎样解决这一问题？肿瘤细胞和淋巴细胞融合,思考,科勒,米尔斯坦,荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。,动物细胞融合技术,B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤,HAT培养基上只有杂交瘤细胞才能活,动物细胞培养,获得产生相应抗体的B淋巴细胞,稀释后在多孔培养板上培养，使每孔只含一个杂交瘤细胞。培养一段时间后，进行专一抗体检测，筛选出呈阳性杂交瘤细胞。,1、制备过程,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.2、用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,2、单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,例题2（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时， 将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ） AT淋巴细胞 B效应B淋巴细胞 C抗体 D记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中， 正确的是 (多选) （ ） AB淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导 B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体 C体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖 D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高， 优越性明显,BCD,ACD,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答： （1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。 方法： 。 原理：,培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞,加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,