郝明志细胞免疫疗法治疗肿瘤内科大会

过继免疫细胞疗法的临床应用及研究进展,福建省重点实验室（福建省肿瘤医院内科研究室）叶韵斌 郝明志,过继免疫细胞疗法的作用,直接清除体内的残存肿瘤细胞和病毒提高机体的整体免疫功能将患者个体化的肿瘤抗原信息递呈给免疫杀伤细胞已成为肿瘤综合治疗方案中，提高治愈率和有效率的关键措施 。,机体抗肿瘤的免疫学效应机制,一、体液免疫应答（略）二、细胞免疫应答细胞免疫在机体抗肿瘤效应中起重要作用。主要有CD4+T细胞、CD8+T细胞、抗原递呈细胞、NK细胞1. CD4+T细胞：参与B细胞、巨噬细胞、NK细胞和CTL细胞的活化和抗肿瘤效应。 A.辅助激活CTL,B细胞,NK，巨噬细胞; B.分泌细胞因子：IL-2，IFN-，TNF- C.少数属于细胞毒性T细胞，具有杀瘤作用,2. CD8+T细胞：在机体的肿瘤效应中起关键作用。 CTL（细胞毒性T淋巴细胞）A. 通过其细胞膜上的T细胞抗原识别受体（TCR），特异性识别MHC分子肿瘤抗原肽复合物，引起T细胞活化、增殖，杀伤肿瘤细胞。B. 分泌细胞因子,3. 抗原递呈细胞：M、DCA. 通过摄取、加工处理和递呈肿瘤抗原，激发特异性T细胞免疫。B. 活化的巨噬细胞通过溶酶体酶直接杀伤,且可通过分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细胞。C. 介导炎症反应D. ADCC(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用),4. NK细胞非特异性免疫应答 A. 非特异性杀伤B.无MHC限制性，无需预先致敏C.不依赖抗体和补体D.ADCC (抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用) E. 释放IFN-,HBV,IL-12,活化DC,Th1,DC,CTL,CD4,CD4,IL-12,NK/NKT,Pathogen,IFN,IL-2IFN,IL-12,机体对肿瘤抗原的免疫应答,过继免疫细胞疗法适应症,过继细胞免疫疗法是指转输具有生物活性的效应细胞，诱导机体产生特异性或非特异性的免疫应答，从而用于治疗肿瘤和病毒相关性疾病的免疫学治疗方法。 只有少数肿瘤单独应用细胞免疫疗法可达到很好的疗效，但对大多数肿瘤，过继免疫细胞疗法作为综合治疗的一部分，用于：手术后防治复发或转移；无法手术、放疗、化疗的中晚期患者；放化疗患者的综合治疗；放化疗失败的患者；癌性胸腹水白血病等。,理想的过继免疫细胞治疗应具有以下特点: (1)可大量获得 ，实验室研究及临床实践显示，临床治疗量的免疫细胞应在1 1010以上 (2)具有抗原特异性 (3)抗肿瘤、抗病毒活性强 (4)体内应用可耐受 (5)可聚集在肿瘤病灶 (6)可在体内存活 、增殖,一、肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）,肿瘤浸润的淋巴细胞，是从新鲜的肿瘤组织中分离出来，体外经IL-2，抗CD3单抗，TNF等刺激，经20-45天培养，获得的具有一定特异性的抗肿瘤细胞。其局限在于分离困难，体外培养时间过长,限制了临床应用。,TIL细胞治疗恶性胸腹水临床经验 我们于1997-1998年选择21例癌性胸腹水患者，共抽取33次胸腹水做TIL细胞培养，21例患者中14例经16次的TIL胸腹腔回输治疗。14例患者回输治疗结果显示总有效率为78.57%，其中3例胸腹水消失，并观察1个月无复发，1个月后检查胸腹水无瘤细胞；8例胸腹水有明显减少，并控制1个月以上；3例仅控制12周。肿瘤浸润淋巴细胞治疗癌性胸腹水的初步观察 浙江肿瘤 1997， 3（3）,二、细胞因子激活的杀伤细胞（CIK）,是将人外周血单个核细胞（PBMC,包括淋巴细胞和单核细胞）经体外用各种细胞因子共同刺激培养所获得的免疫细胞。由于同时表达CD3和CD56分子，故又称为NK样T细胞，CIK细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，其抗肿瘤活性远大于LAK和TIL。因此被认为是新一代肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。,引进日本的无血清培养技术，体外高效培养CIK细胞只需50 ml 全血，培养1020天，可供36次的回输，回输细胞总量达11010CD3CD56细胞比例显著增加,治疗205例肿瘤患者（肝癌、肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、鼻咽癌、等）,TACE+CIK治疗原发性肝癌,资料: 72 patients were treated with TACE + CIK 74 patients were treated with TACE only 同期非随机对照(年龄、AFP、分期、肝功能、肿瘤结节数等方面有可比性)结果:治疗组与对照组中位OS分别为31个月 vs. 10个月。 中位TTP分别为11个月 vs. 5个月。两组半年、1年、2年生存率分别为 91.3%、71.9%、62.4% vs. 74.6%、42.8%、18.8结论: TACE+CIK能够明显提高介入治疗效果，延长疾病进展时间，提高远期生存率。,TACE+CIK治疗原发性肝癌,两组基线材料比较,无病生存时间/总生存时间生存分析,Hao MZ. C Qiang. Ye YB. et al. Efficacy of transcatheter arterial chemoembolization combined with cytokine-induced killer cell therapy on hepatocellular carcinoma: a comparative studyChi J of cancer 2010，29（2）：182-189,CIK在介入术后应用时机,肝癌术后补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗对复发率及生存率的影响福建省科技厅青年人才项目 2006F3035 负责人余文昌,方法：对2006年-2009年在本院行肝癌切除术的50例HCC患者，按术后是否补充TACE术联合CIK细胞免疫治疗分为研究组(25例)和对照组(25例), 对比分析两组患者术后l、2、25年的累积复发率和生存率。结果：两组1、2、2.5年的累积复发率分别为 287、382、519 Vs. 324、526、605， 两组1、2、2.5年的累积生存率分别为 100、889、698% vs 96、749、642结论: 肝癌切除术后补充TACE+CIK治疗是降低患者复发率及延长生存期的有效手段。肝癌术后补充动脉插管化疗栓塞术联合细胞免疫治疗对复发率及生存率的影响.微创医学.2009,4(5):459-461,CIK细胞疗法治疗HCC-典型病例,患者，74岁，男性，以体检发现肝占位3月于2007年3月26入院，当时MRI:肝硬化结节恶变，表现为弥漫多发结节，最大者1.1cm；AFP:3710 ng/ml。肝功能child-pugh分级B级。患者心肺功能差，同时合并酒精性肝硬化、冠心病、房颤、糖尿病、甲减、肺间质改变、脑梗塞等，无法耐受手术、介入治疗等，而采用CIK细胞免疫疗法+支持治疗。4月13日开始CIK回输，4月26日复查AFP229 ng/ml，出院休息。电话随访，5月底在外院查AFP20 ng/ml，其后未进一步治疗。08年5月体检肿瘤复发，AFP32360ng/ml，MRI：肝多发肿瘤伴门脉瘤栓，最大肿瘤5cm，病灶较2007年3月片明显增多增大。再次CIK治疗未见明显疗效。7月消化道出血，脑梗塞去世。,CIK治疗胃癌-实验研究,方法： 取正常人外周血单个核细胞，体外诱导成 CIK细胞， 在 Balb/c裸小鼠腹腔内接种胃癌细胞株OCUM-2MD3， 观察 CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。结果： 体外实验证明， CIK细胞对胃癌细胞株OCUM-2MD3 有明显的细胞毒活性。体内实验表明， CIK细胞能够显著抑制癌性腹水的生长， 其抑100%； 肿瘤标志物 CEA含量明显降低。结论: CIK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞，具有较强的体内外抗胃癌细胞活性，具有明显的抑制癌性腹水的生长的作用， 有可能用于临床上晚期胃癌的过继性免疫治疗。,CIK治疗病毒性肝炎,文献报道自体CIK治疗乙型肝炎肝硬化和白血病合并丙型病毒性肝炎，取得以下成效：CIK细胞治疗改善肝脏功能CIK细胞治疗抑制病毒复制综合国内外的研究，CIK免疫细胞疗法在病毒性肝炎的防治中起到重要作用。,CIK输注不良反应,免疫活性细胞回输后患者可出现一过性类流感样症状，如发热（体温37.539.5），轻度头痛、乏力、关节酸痛，持续时间均不超过12 h， 可自行缓解，所有患者均能很好耐受治疗。,由于该治疗技术能在一定程度上打破免疫耐受、进而清除病毒和肿瘤细胞，因此不仅是治疗病毒感染性疾病的重要方法，也成为继手术、化疗、放疗后的肿瘤第四疗法。1999年国家食品药品监督管理局批准将自体CIK用于治疗急性白血病及慢性丙肝。2001年CIK疗法作为经常性医疗项目，进入全国医疗服务价格项目规范。目前在我省也列入各级医保项目。,三、自然杀伤细胞（NK）,为机体免疫的第一道防线表面标志： CD3-/CD16+/CD56+,NK细胞受体和配体,叶韵斌，周志锋，郑蕊蕊，等，KIR不相和NK细胞对乳腺癌体外杀伤 作用，中国肿瘤生物肿瘤杂志 2007，14（1）郑蕊蕊, 叶韵斌, 陈强. 杀伤细胞免疫球蛋白样受体与肿瘤免疫治疗J.中国肿瘤,2006,15(1):39-42.,NK细胞依赖受体与相应配体结合以实现其生物学功能。,MICA在各种肿瘤中表达,MICA是NK细胞表面活化性受体NKG2D的相应配体，不表达于正常组织细胞或仅低表达于肠上皮细胞上皮来源的原发性肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等细胞高表达。Busche等报道人肺癌组织有30%的MICA表达。而Jennifer等报道前列腺癌95%表达，说明各种癌MICA表达不一样。而且，同种肿瘤由于生物学行为的不同，也出现MICA表达的不均一性。我们用流式细胞术检测乳腺癌细胞株MICA的表达, 结果, MCF-7、MDA-MB-231表达MICA，而SK-Br3不表达。乳腺癌细胞表面表达的MICA分子可上调NK细胞表面NKG2D的表达,激发NK细胞对乳腺癌细胞的细胞毒效应.,目前已经观察了人HCC中MICA 的肿瘤特异性表达形式以及NK细胞通过 MICANKG2D 途径对HCC细胞的识别。晚期HCC患者中，从肿瘤细胞表面脱落的可溶性的MICA能下调NKG2D的表达，并且抑制NKG2D介导的免疫应答。这可能是晚期HCC免疫逃逸机制中的一个环节。 最近研究发现，催化色氨酸分子氧化裂解的限速酶-吲哚胺2 ,32双加氧酶 (IDO)具有抗肿瘤作用，其主要机制就是上调NK细胞的活性，抑制 IDO 可以降低 NK细胞的活性，并且呈剂量依赖关系，可见NK细胞在抗肝癌免疫中发挥重要作用的 。,肿瘤细胞表面MICA存在是NK细胞杀伤肿瘤的重要分子机制。通过测定肿瘤细胞表面MICA的表达水平，可预测NK细胞为主的免疫治疗的疗效。换句话说，可以根据患者肿瘤组织MICA水平决定是否进行免疫治疗或采取何种免疫治疗，避免了盲目性。 美国已经开始该方面的临床治疗研究,四、DC细胞,树突状细胞（Dendritic Cells, DC） 是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞（Antigen presenting Cells,APC），能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。 DC-T细胞相互作用缺陷可导致特异性T细胞免疫缺陷。,CD4+ T 细胞,CD8+ T 细胞,NK 细胞NKT 细胞,树突状细胞（DC）,体外实验证实，人DC至少有三条来自于不同前体细胞的发育途径：1）CD34+细胞分化为DC2）外周血单核细胞分化为DC3）淋巴样DC前体细胞分化途径,我们比较了人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导DC的方法及其特性。 -外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-等诱导下，分化为DC， -脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、 TNF-、SCF、FL、TPO等因子作用下，可生成DC，表达相应的分化抗原CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR，并具有诱导CTL的功能。人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突状细胞比较 福建医科大学学报 2003，37（2）,DC在 肝癌治疗中 作用途径,细胞水平： 肝癌裂解物、凋亡的肝癌细胞可致敏DC， 回输体内,有效诱发机体的抗肝癌免疫应答 。该方法简单易行,可激发针对多个肝癌抗原的 T淋巴细胞免疫,减少了癌细胞逃逸的可能性。 灭活的肝癌细胞可与DC融合，使肿瘤抗原可直接在融合细胞内被加工呈递 ,保证了抗原的完整有效及充分呈递。蛋白水平： 将 DC与肝癌相关抗原肽或肝癌可溶性抗原在体外共同孵育,使肝癌抗原肽结合在 DC表面的 MHC2类分子上,再回输体内,可以引起较强的 CD4 和CD8 的 T细胞免疫以治疗肝癌。基因水平： 肿瘤抗原基因可通过重组腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体或直接以裸 DNA或 RNA方式导入 DC,再免疫机体。,由于大多数肿瘤抗原未被识别，因此肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗可使更多的患者接受此种方法治疗。,DC-CIK治疗,DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别抗原、激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞,二者联合确保了一个高效和谐的免疫体系。DC和CIK共同培养后具有更强的肿瘤杀伤活性,杀瘤谱更广,并且还能在低效靶比条件下清除肿瘤细胞。,DC介导的抗肿瘤免疫治疗具有很大的潜力 ,但目前进行的工作还处于探索阶段： -如何增强 DC疫苗的免疫效果 -肿瘤抗原的选择、剂量的确定 -输注途径 -最佳疫苗剂量 -疫苗接种时间间隔等,在异基因的造血干细胞移植（Allo-HSCT）中观察到混于干细胞或由干细胞生成的免疫细胞能够产生有力的移植物抗肿瘤（GVT）效应。这种通过同种异基因免疫细胞的输注或干细胞的移植来介导肿瘤的免疫反应的治疗方法称肿瘤的异基因免疫治疗，也是一种过继免疫治疗。 李晓峰，陈强. 肿瘤异基因免疫治疗研究现状. 福建医科大学学报 2005;39:64-66,五、非清髓性异基因免疫治疗 （HLA半相合免疫细胞治疗）,原理：低剂量或常规剂量的化疗预处理，使患者的免疫功能没有受到充分的抑制，尚存的T细胞和NK细胞可攻击MHC不相合的供者细胞，通过HVGR把供者细胞清除了； 而单倍体相合的供者细胞由于被受者兼容，尚存的受者细胞不会攻击供者细胞，不产生HVGR。但供者T细胞和NK细胞可以攻击宿主，依靠移植物抗肿瘤（GVT）作用产生一系列的免疫反应。林浩，叶韵斌，李晓峰，等，单倍体相合细胞移植诱发小鼠移植物抗肿瘤效应的分析，中国组织工程研究与临床康复，2008；12（3）,动物试验,单倍体相合细胞移植的GVT（移植物抗肿瘤瘤）效应。探索保留GVT效应、减轻GVHD反应的方法,移植方式,建立BABL/CC57BL/6杂交F1代小鼠H22肝癌实体瘤模型，以C57BL/6为供者，F1为受者。受者分为化疗预处理和无化疗预处理者。无化疗预处理小鼠则于接种H22肿瘤细胞后第3天开始腹腔注射NS，8ul/(kg.d)，连续4天 。化疗预处理的方案为：接种H22肿瘤细胞后第3天开始对荷瘤F1小鼠进行环磷酰胺（CTX）腹腔化疗，以生理盐水将环磷酰胺稀释成10mg/ml，80mg/(kg.d)腹腔注射，连续注射4天。,瘤重和抑瘤率,1）与单化疗无移植组比：P0.05。陈强，李晓峰，叶韵斌，等。MHC半相合脾加骨髓细胞诱发H22荷瘤鼠的抗肿瘤反应 中国肿瘤生物治疗杂志2006，13（2）：107-1112李晓峰，叶韵斌，陈强，等。BABL/CC57BL/6杂交F1代小鼠H22肝癌实体瘤模型的建立 福建医科大学学报2006，40（4）：387-390,结论: 预处理是必须的；单倍体相合细胞移植可产生抗肿瘤效应,无化疗组小鼠没有经预处理、输入单倍体相合供者细胞 ，没有嵌合体形成，也没有抗肿瘤效应出现。化疗+经照射单倍体移植组，通过流式细胞术和PCR法，都可以检测到嵌合体的形成，并观察到抑制肿瘤的效应的存在，其抑制肿瘤作用与单纯预处理无移植组比较，差异具有显著的统计学意义，P0.01。 没有预处理就没有嵌合体的形成、没有嵌合体的形成就没有抑制肿瘤效应的出现，反之亦然，这种结果提示预处理是移植植活的必要条件，移植植活与抗肿瘤效应有关，因此这种抗肿瘤效应是GVT效应,结论: 供者细胞经7.5Gy 60CO照射的移植可以在减轻GVHD反应的情况下保留GVT效应,从本实验结果可以看出：供者细胞未经60CO照射组小鼠在移植后第11天左右出现弓背、耸毛等表现，接着出现倦怠、纳差、毛发无光泽、脱毛、步态不稳、腹泻等GVHD的症状，移植后第14天出现体重下降，病理检查证实为严重的GVHD。而供者细胞经60CO照射的小鼠除移植后第14天开始出现体重下降外，没有其它GVHD的临床症状，但病理学检查提示仍有一定的GVHD损害，只是程度较F组小鼠明显轻，延长观察时间至移植后第34天，没有发现损害程度加重的表现。,体外研究结果,T细胞和NK细胞去除实验结果显示：去除供者T细胞和NK细胞的移植都使GVT效应显著下降，提示T细胞和NK细胞都是