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文档简介
.,1,氨基酸分析,1958Spackman,SteinandMoore第一次实现氨基酸自动分离和定量,NH2RCCOOHH,UV-210nm,.,2,氨基酸衍生化方法,柱后衍生柱前衍生,氨基酸,衍生化后的氨基酸,试剂,色谱柱,检测器,色谱柱,检测器,.,3,氨基酸,试剂,色谱柱,检测器,柱后衍生,色谱柱:阳离子交换柱试剂:茚三酮方法-UV/VIS检测器OPA方法-荧光检测器,.,4,柱后衍生化分离柱,阳离子交换柱使用阳离子交换柱,峰分离度较差。分析所有的氨基酸所需时间较长。蛋白质水解氨基酸(45min)生物体氨基酸(120min),.,5,茚三酮方法,伯氨基酸和仲氨基酸(亚氨基酸)检测:440nm(脯氨酸)or570nm(primary)反应温度:130反应速度:快速试剂稳定性:不稳定(必须冷藏)衍生化产物稳定性:稳定,.,6,茚三酮方法,阳离子交换柱,UV/VIS检测器,茚三酮试剂,130,氨基酸,柱温箱,反应器加热器,.,7,OPA方法(邻苯二甲醛),伯氨基酸检测:荧光检测器(Ex=350nm,Em=460nm)反应温度:室温反应速度:快速试剂稳定性:较差衍生化产物稳定性:较差,.,8,脯氨酸和羟基脯氨酸分析,脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂发生反应在与OPA反应前两种氨基酸应先使用下列试剂进行氧化次氯酸盐氯胺T,.,9,OPA衍生反应辅助试剂,有硫醇存在时,OPA才会与伯氨基酸发生反应,乙硫醇2-硫基乙醇3-硫基丙酸(非挥发性),.,10,OPA方法,阳离子交换柱,荧光检测器,氨基酸,柱温箱,OPA试剂,次氯酸盐,.,11,茚三酮方法和OPA方法比较,.,12,衍生化后的氨基酸,色谱柱,检测器,柱前衍生,色谱柱:反相柱(ODS)试剂:OPA(荧光检测)FMOC(荧光检测)荧光胺(荧光检测)DANS-Cl(荧光检测)PITC(UV),.,13,柱前衍生分离柱,反相色谱柱(ODS)使用反相柱,色谱峰分离良好。分析某些类型的氨基酸所需时间很短蛋白质水解氨基酸(20min)生物体氨基酸(60min),.,14,OPAMethod(o-phthaldialdehyde),伯氨基酸检测:荧光检测器(Ex=380nm,Em=420nm)反应温度:室温反应速度:快速,.,15,OPA柱前衍生化色谱图,生物体氨基酸标准品,Shim-packCLC-ODS,.,16,FMCO方法(9-fluorenylmethyoxycarbonylchloride),通用试剂,用于缩氨酸N端保护,.,17,荧光胺方法,pH7时与伯氨基酸快速反应易于水解,.,18,DANS-Cl方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonylchloride),与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低,.,19,PITC方法(phenylisothiocyanate),ForpeptideandproteinsequencingasEdman抯reagent伯氨基酸和仲氨基酸(碱性条件)反应时间长使用UV检测器,灵敏度低,PITC,PTC,.,20,PTC-氨基酸色谱图,STRODS-II,氨基酸标准品,.,21,自动氨基酸分析仪,对于“柱前”和“柱后”自动氨基酸分析仪来说,采用何种方法更好?要控制反应时间,采用柱后衍生方法更方便。这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。柱后衍生重复性,RSD约为1%柱前衍生重复性,RSD2%,.,22,Shimadzu氨基酸分析系统,.,23,氨基酸分析流程图,.,24,分离柱,强酸性阳离子交换树脂(带有磺化基团的苯乙烯二乙烯基苯共聚物)Na型andLi型Shim-packAMINO-Na,用于水解氨基酸分析Shim-packAMINO-Li,用于生物体氨基酸分析,.,25,水解氨基酸色谱图,.,26,生物体氨基酸色谱图,.,27,流动相,Na型A溶液:0.2N柠檬酸钠(用高氯酸调pH至3.2)B溶液:0.6N柠檬酸钠/0.2M硼酸(用4MNaOH调pH至10.0)C溶液:0.2NNaOH(用于清洗色谱柱)Li型A溶液:0.15N柠檬酸锂/7%甲氧基乙醇(用硼酸调pH至2.6)B溶液:0.3N柠檬酸锂/0.2M硼酸用4MLiOH调pH至10.0)C溶液:0.2NLiOH(用于清洗色谱柱),.,28,PH梯度,HHHR-C-COOHR-C-COOHR-C-COO-NH3+NH2NH2,分离是通过离子力进行的,.,29,N-acetylcystine作为辅助试剂,.,30,什么是氨捕集柱?,流动相中的氨,无捕集柱,有捕集柱,.,31,重复性(各250pmol),(n=10),.,32,线性,.,33,高灵敏度分离色谱图,25pmol氨基酸标准品,.,34,样品预处理,脱脂去蛋白蛋白质水解样品稀释过滤,.,35,脱脂,脂类组分会影响分析柱使用弱极性溶剂乙酸乙酯氯仿正己烷等两相分离后,水相必须使用0.45um滤膜过滤,.,36,除蛋白,蛋白组分会干扰氨基酸的分离除蛋白试剂酸性溶剂方法有机溶剂方法超滤方法蛋白沉淀物必须采用离心(3000rpm,5min)或过滤方法除去.,.,37,酸性溶剂方法,三氯乙酸(5-10%水溶液)高氯酸(0.1-1%水溶液)除去蛋白后,通过加NaOHorLiOH以中和溶液(溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.),.,38,有机溶剂方法,乙腈乙醇聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。如果采用有机溶剂方法,进样量应尽可能小。,.,39,超滤方法,效率高成本低,.,40,老鼠血清中游离氨基酸分析,.,41,牛尿中游离氨基酸分析,.,42,猪血粉中游离氨基酸分析,.,43,茶叶中游离氨基酸分析,.,44,蛋白质水解(1),高氯酸水解方法6N-HCl110C(N2氛围)22-72hours色氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸分析不能用此水解方法(可用其它方法).天冬酰胺酸和谷氨酸转换成酸的形式。,.,45,蛋白质水解(2),碱水解方法4NNaOH110C(N2氛围)16-24hours这一方法用于色氨酸,.,46,蛋白质水解(3),过甲酸氧化方法A/B=5/95110C(N2氛围)A:30%过氧化氢B:90%甲酸22-72h这一方法用于半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸分析,.,47,盐酸水解方法实例,从胰腺得到的胰岛素中的水解氨基酸分析,.,48,氨基酸残留基团测定值和理论值比较,.,49,碱水解方法实例,意大利草中水解氨基酸分
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